小分子RNA調(diào)節(jié)anti-BPDE轉(zhuǎn)化的支氣管上皮細(xì)胞和肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng).pdf

1、廣州醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文小分子RNA調(diào)節(jié)anti-BPDE轉(zhuǎn)化的支氣管上皮細(xì)胞和肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)姓名：韓志遠(yuǎn)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：蔣義國(guó)2011-06廣州醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文 小分子 R N A 調(diào)節(jié) a n t i - B P D E 轉(zhuǎn)化的支氣管上皮細(xì)胞和肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng) 4 研究?jī)?nèi)容與方法： 第一部分：小分子RNA miR- 622通過(guò)調(diào)控K- Ras抑制anti- BPDE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng) 利用 miRNA芯片觀察

2、惡性轉(zhuǎn)化的 16HBE- T細(xì)胞給予化學(xué)預(yù)防和抗癌藥物白藜蘆醇處理前后的 miRNA 表達(dá)譜變化。利用 Trizol試劑提取處理前后的細(xì)胞的總 RNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量 RT- PCR 方法驗(yàn)證芯片結(jié)果和檢測(cè) miR- 622 在16HBE- T和正常 16HBE細(xì)胞中的表達(dá)。 運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法瞬時(shí)導(dǎo)入 miR- 622模擬物或 miR- 622 的抑制劑使內(nèi)源性 miR- 622 表達(dá)升高或降低。轉(zhuǎn)染 miR- 622模擬物和 m

3、iR- 622 的抑制劑后的 16HBE- T 細(xì)胞用于下游的實(shí)驗(yàn)包括細(xì)胞增殖（CCK- 8 方法） 、細(xì)胞周期（流式細(xì)胞儀 PI 單染方法） 、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)。使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè) miR- 622 的下游靶點(diǎn)，篩選到 K- Ras 這個(gè)靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)染 miR- 622 模擬物和 miR- 622 的抑制劑后的 16HBE- T 細(xì)胞，提取總 RNA和蛋白， 以實(shí)時(shí)熒光定量 RT- PCR 和 Western- blott

4、ing 檢測(cè) K- Ras mRNA 和蛋白的表達(dá)。以雙熒光報(bào)告基因表達(dá)載體的方法來(lái)鑒定 miR- 622 的直接靶點(diǎn) K- Ras。最后 16HBE- T 細(xì)胞預(yù)處理 K- Ras 抑制劑 FTS 4 天后，再轉(zhuǎn)染 miR- 622 模擬物，通過(guò) CCK- 8 方法和流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的變化。 第二部份： 小分子 RNA miR- 497 和 miR- 34a 共同靶向 cyclin E1 調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)

5、 第一部份中我們從芯片結(jié)果中篩選出 miR- 497 和 miR- 34a 進(jìn)行功能驗(yàn)證。 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量 RT- PCR 方法檢測(cè)人正常支氣管上皮細(xì)胞 16HBE 和肺癌細(xì)胞株A549、H460、H1299、H446 和 QG- 56 中 miR- 497 或 miR- 34a 的表達(dá)水平。通過(guò)lipofectamine- 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法瞬時(shí)導(dǎo)入 miR- 497 或 miR- 34a 的模擬物和抑制劑以升高和降低 mi

6、R- 497 或 miR- 34a 的表達(dá)以進(jìn)行下游功能的研究。A549、H460 和 H1299 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR- 497 或 miR- 34a 的模擬物或抑制劑后，通過(guò) CCK- 8和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布情況。A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR- 497 或miR- 34a 的模擬物后，進(jìn)行軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)。使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè) miR- 497 和 miR- 34a 的靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)到一個(gè)共同靶點(diǎn)細(xì)胞周期素 E