轉(zhuǎn)化生長因子β不敏感的樹突狀細胞疫苗對小鼠肺轉(zhuǎn)移腎癌的免疫治療作用研究.pdf

1、目的：樹突狀細胞（DC）是一種最強的抗原遞呈細胞，目前在腫瘤疫苗中已被廣泛應(yīng)用。但是它們抑制腫瘤的能力經(jīng)常被腫瘤分泌的免疫抑制因子所抑制，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)。在本研究中，我們應(yīng)用TGF-β不敏感的DC疫苗免疫荷瘤小鼠來評論其對肺轉(zhuǎn)移腎癌的治療效果。我們應(yīng)用包含顯性負相II型TGF-β受體（TβRIIDN）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒來感染腫瘤裂解物沖擊過的DC細胞。TβRIIDN能夠阻斷TGF-β向Smad-2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致核內(nèi)下游基

2、因的轉(zhuǎn)錄被切斷。應(yīng)用TβRIIDNDC免疫Renca肺轉(zhuǎn)移癌的小鼠可以誘導(dǎo)強大的針對Renca的腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應(yīng)，抑制肺轉(zhuǎn)移，延長小鼠生存期。這些結(jié)果顯示阻斷DC的TGF-β信號通路可以增強DC疫苗抗腫瘤的效率。
　　方法：1）構(gòu)建含有顯性負相TGF-βII型受體（TβRIIDN）質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒：含有TβRIIDN質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染293包裝細胞，32℃下共轉(zhuǎn)染12小時，10％DMEM培養(yǎng)基37℃下孵

3、化過夜，PBS漂洗后同樣條件再次轉(zhuǎn)染293細胞24小時，收集上清，獲得含有TβRIIDN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。2）負載小鼠腎癌Renca抗原的DC細胞分離、培養(yǎng)及鑒定：將Balb/c小鼠新鮮骨髓用紅細胞去除法獲取DC細胞，加入含rhIL-4（1000U/ml）、GM-CSF（1000U/ml）的完全培養(yǎng)基，隔日半量換液，在第6d梯度離心收獲非粘附細胞為非成熟的DC細胞。反復(fù)凍融獲得Renca細胞裂解物，裂解物反復(fù)刺激沖擊非成熟的DC細胞獲得負

4、載腎癌抗原的成熟DC細胞（TP-DC）。于光鏡下形態(tài)學(xué)鑒定，用流式細胞儀檢測細胞表型MHCclassII，CD40，CD11c，CD80和CD86。
　　3）DC細胞轉(zhuǎn)染，獲取TGF-β不敏感TP-DC細胞（TGF-βinsensitiveTP-DC）：含有TβRIIDN及GFP基因及單純GFP基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染負載Renca抗原的TP-DC細胞5％CO2、37℃下孵化48小時，獲得表達TGF-βinsensitiveTP-D

5、C細胞，及GFPTP-DC細胞，流式細胞儀檢測DC細胞表型變化。
　　4）TβRIIDN-DC細胞體外實驗：不同的DC細胞與TGF-β共同培養(yǎng)，脫氧胸腺嘧啶苷核素摻入法進行增殖抑制實驗，Westernblot檢測Smad-2和磷酸化Smad-2的表達。
　　5）DC疫苗體內(nèi)抗腫瘤評價：建立腎癌Renca肺轉(zhuǎn)移小鼠模型Balb/c小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，分別尾靜脈注射Renca細胞5×105個。于注射后第7天分別

6、皮下注射TGF-βinsensitiveTP-DC細胞、GFPTP-DC細胞、TP-DC細胞和新分離培養(yǎng)成熟的DC（na?veDC）第10天重復(fù)注射一次，觀察至第60天各組荷瘤小鼠的生存情況和肺重量的改變。
　　6）體外CTL活性及細胞因子檢測：取另一組同法建立的免疫后小鼠模型，最后一次疫苗免疫后10d取其脾臟，分離活化T淋巴細胞，51Cr釋放實驗測定腫瘤特異性殺傷T細胞(CTL)對Renca細胞的細胞毒作用。小鼠乳腺癌EMT-6

7、作為對照靶細胞。取小鼠血清行酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定細胞因子IFN-γ和IL-2變化情況。
　　結(jié)果：
　　1）流式細胞儀分析：小鼠骨髓來源的DC細胞純度為84.88％。對GFP熒光分析提示TβRIIDN和GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率分別為92.13％和91.95％。對標志成熟的表明分子MHCclassII，CD40，CD80和CD86的分析提示3種TP-DC明顯高于na?veDC（p<0.05），但3種TP-DC之間并

8、無明顯差異（p>0.05）。
　　2）Smad2磷酸化的檢測：western-blot顯示Smad2在4組DC中均存在，但是當應(yīng)用TGF-β孵育后，磷酸化的Smad2（P-Smad2）只在GFPTP-DC,TP-DC,和na?veDC中存在，在TGF-βinsensitiveTP-DC并沒有見到P-Smad2。說明TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被TβRII顯性負相表達所阻斷。
　　3）與TGF-β共同培養(yǎng)24h后，TP-DC，GFPT

9、P-DC和TGF-βinsensitiveTP-DCT的脫氧胸腺嘧啶苷核素攝入抑制率分別為61.7±4.2％,62.3±3.5％和14.3±1.4％，TGF-βinsensitiveTP-DC的脫氧胸腺嘧啶苷核素攝入抑制率與其他各組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　4）在成功構(gòu)建的Renca肺轉(zhuǎn)移的小鼠模型上分別接種4種DC疫苗，TP-DC組肺重量及生存期均較na?veDC組有明顯差異（p<0.001）。TGF-β

10、insensitiveTP-DC組較其他兩組TP-DC也有明顯差異（p<0.05）。這些結(jié)果說明TGF-β不敏感的DC細胞能有效提高Renca肺轉(zhuǎn)移小鼠的生存率降低肺轉(zhuǎn)移率。
　　5）51Cr釋放實驗測定顯示3組TP-DC組CTL殺傷活性均較na?veDC組強。但是最強的殺傷活性出現(xiàn)在TGF-βinsensitiveTP-DC組，在E:T為100：1時，殺傷活性為76.4％。所有DC組CTL對小鼠乳腺癌細胞EMT-6無明顯殺傷作用

11、。結(jié)果表明阻斷的TGF-β信號通路能增加腫瘤特異性殺傷活性，提高DC疫苗的效能。
　　6）接種na?veDC的荷瘤小鼠體內(nèi)測出IFN-γ和IL-2基礎(chǔ)水平，接種各種TP-DC的荷瘤小鼠體內(nèi)IFN-γ和IL-2水平明顯升高，接種TGF-βinsensitiveTP-DC的荷瘤小鼠體內(nèi)該兩種細胞因子水平升高更明顯。
　　結(jié)論：
　　1）成功構(gòu)建了含有TβRIIDN質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒；
　　2）采用小鼠腎癌細胞系Renc

12、a細胞裂解產(chǎn)物作為抗原加載Balb/c小鼠骨髓DC，誘導(dǎo)出了腎癌的DC；
　　3）使用修飾后TβRII基因轉(zhuǎn)染腎癌特異性的DC，使TβRII顯性負相表達，阻斷TGF-β信號通路；
　　4）TβRIIDN并不影響轉(zhuǎn)染DC細胞的表型；
　　5）TGF-β不敏感的DC細胞能明顯提高Renca肺轉(zhuǎn)移小鼠的生存率，明顯抑制腫瘤生長。
　　6）TGF-β不敏感的DC細胞誘導(dǎo)出最強的CTL殺傷活性，E/T比率為100:1時殺傷