RNA干擾酪氨酸激酶受體2對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、早在1971年，F(xiàn)olkman就提出了腫瘤生長(zhǎng)具有血管生成依賴性這一概念，以后陸續(xù)有實(shí)驗(yàn)研究表明，腫瘤連續(xù)性生長(zhǎng)必需有血管形成，當(dāng)實(shí)體瘤生長(zhǎng)到直徑為2mm時(shí)，如繼續(xù)生長(zhǎng)，就需要血管供應(yīng)的保障，瘤細(xì)胞可能產(chǎn)生一種腫瘤血管生長(zhǎng)因子促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂，出現(xiàn)新的毛細(xì)血管，進(jìn)而溝通血流，進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)，保證瘤組織的氧和營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)，新生血管為腫瘤代謝產(chǎn)物的排除提供了途徑，因此，血管生成是腫瘤侵襲性生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)?？鼓[瘤的血管形成治療，尤其是抗

2、腫瘤的血管形成基因療法、尋找最佳抗腫瘤血管形成的靶位成了當(dāng)今腫瘤治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 血管內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤血管生成中起著極為重要的作用。機(jī)體的血管形成有兩種方式：血管發(fā)生和血管生成。血管發(fā)生是胚胎發(fā)育過(guò)程中成血管細(xì)胞發(fā)展、形成原始血管的過(guò)程，包括內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖、遷移、連接并形成原始血管叢等。血管生成是原始血管叢或已存在的血管經(jīng)發(fā)芽或其他方式形成新血管的過(guò)程，包括內(nèi)皮細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)，并通過(guò)趨化移動(dòng)、增殖，形成新管腔等過(guò)程。因

3、此，以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗血管新生治療已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。針對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞抗腫瘤血管生成有以下優(yōu)勢(shì)：①血管內(nèi)皮細(xì)胞基因組較為穩(wěn)定，針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞治療不易獲得耐藥；②正常成熟組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，而腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活躍，出現(xiàn)許多相對(duì)特異標(biāo)記分子，如整合素aVB3、E-選擇素、VEGF受體及Tie，它們的表達(dá)較正常靜止內(nèi)皮細(xì)胞高50倍以上，是抗腫瘤血管生成的分子。③從理論上推算一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞要飼養(yǎng)50-100個(gè)腫

4、瘤細(xì)胞，針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞比直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞治療更為有效。④腫瘤生成血管依賴性是所有腫瘤共有的，理論上適合各種腫瘤。 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有分化潛能和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性，且它對(duì)包括炎癥因子在內(nèi)的多種體內(nèi)因子均有很好的反應(yīng)性，與動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，可使實(shí)驗(yàn)條件和所獲得結(jié)果更符合人體情況。因而，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是研究腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞理想細(xì)胞模型。 Tie2是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的除血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）之外的另一參與血

5、管生成調(diào)控的主要基因，其是幾乎完全由血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的酪氨酸激酶受體，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、水解基底膜、遷移和血管構(gòu)建的調(diào)控作用較強(qiáng)且特異性高。有研究報(bào)道缺乏Tie2基因的小鼠往往死于胚胎期的血管發(fā)育障礙，提示Tie2在血管生成中起重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，部分對(duì)阻斷VEGF途徑無(wú)生物反應(yīng)的腫瘤常表達(dá)Tie2，而單獨(dú)阻斷Tie2途徑可抑制這一部分的腫瘤生長(zhǎng)，提示Tie2和VEGF信號(hào)通路是調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的兩條獨(dú)立的途徑。 RNA

6、干擾是特異性基因表達(dá)沉默的強(qiáng)有力手段之一，其廣泛存在真核生物中，是生物體在進(jìn)化上的一種保守的基因組水平的免疫監(jiān)控機(jī)制。具有高度特異性、高效率、放大效應(yīng)并可遺傳的特點(diǎn)。作為一種新的反向遺傳學(xué)研究基因功能的方法克服了正向遺傳學(xué)中預(yù)測(cè)性基因功能分析的存在假陽(yáng)性結(jié)論的缺點(diǎn)，這種高通量的基因沉默技術(shù)能夠抑制生物體基因組內(nèi)每一條基因的表達(dá)，從整體系統(tǒng)地研究基因的功能及不同基因間的關(guān)系。 為了進(jìn)一步探討Tie2基因?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的

7、影響，為后期進(jìn)行體內(nèi)抑制腫瘤血管生成的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)，為腫瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000介導(dǎo)，將含有針對(duì)Tie2的特異性shRNA轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs中。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)各組HUVECs中Tie2的mRNA及蛋白表達(dá)的改變情況，MTT法檢測(cè)HUVECs的生長(zhǎng)曲線變化，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情

8、況。 研究?jī)?nèi)容共分為四章：第一章人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離純化及鑒定；第二章Tie2在HUVECs中的表達(dá)及意義；第三章pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定；第四章pGenesil1.1-Tie2-shRNA重組質(zhì)粒干擾HUVECs中Tie2表達(dá)及其對(duì)HUVECs增殖的影響。 第一章人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離純化及鑒定。 1.目的： 體外分離培養(yǎng)HUVECs，并鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為

9、血管內(nèi)皮細(xì)胞。 2.方法： 從中山醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科獲取健康新鮮足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶，以酶消化法獲得HUVECs并進(jìn)行培養(yǎng)，制備細(xì)胞爬片，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，經(jīng)免疫細(xì)胞熒光技術(shù)鑒定，根據(jù)參考相關(guān)文獻(xiàn)制定判定標(biāo)準(zhǔn)，證明所培養(yǎng)細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。 3.結(jié)果: 以酶消化法可獲得以HUVECs為主的混合細(xì)胞懸液，經(jīng)反復(fù)貼壁法分離純化內(nèi)皮細(xì)胞，Ⅷ因子免疫熒光化學(xué)法顯示分離純化所獲得的HUVECs95%以上的細(xì)胞

10、胞漿內(nèi)有熒光表達(dá)，證實(shí)了所純化的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。 第二章 Tie2在HUVECs中的表達(dá)及意義。 1.目的： 檢測(cè)HUVECs中Tie2 mRNA水平及蛋白表達(dá)水平。旨在探討Tie2在體外血管生成中的作用。 2.方法： 收集生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按Trizol試劑盒說(shuō)明抽提總RNA，Tie2mRNA的表達(dá)按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)HUVECs中Tie2蛋白的表達(dá)水平

11、：以Tie2兔抗人多克隆抗體為一抗，按SABC免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，DAB顯色。每批次均以PBS代替一抗作陰性對(duì)照片一張，以已知Tie2高表達(dá)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304和博士德公司提供的Tie2陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果按照Birner等報(bào)道的方法進(jìn)行判定。 3.結(jié)果： Tie2基因在體外培養(yǎng)的HUVECs中呈高水平表達(dá)。 第三章 pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。

12、 1.目的： 構(gòu)建pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質(zhì)粒。 2.方法： 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找Tie2的mRNA全序列，根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)能編碼Tie2-shRNA的寡核苷酸鏈，交武漢晶賽公司合成。根據(jù)pGenesil1.1-U6-shRNA質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖，將pGenesil1.1用Eco31Ⅰ酶切使其線性化；將稀釋退火片段與線性化pGenesil-1.1質(zhì)粒表達(dá)載體的連接構(gòu)建pG

13、enesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定并測(cè)序證實(shí)與設(shè)計(jì)一致。 3.結(jié)果： 成功構(gòu)建pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)所構(gòu)建的質(zhì)粒與設(shè)計(jì)的完全相符。 第四章 pGenesil1.1-Tie2-shRNA重組質(zhì)粒干擾HUVECs中Tie2表達(dá)及其對(duì)HUVECs增殖的影響 1.目的： 探討應(yīng)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)沉默

14、Tie2基因，觀察其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs增殖活性的影響，為將來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行抑制腫瘤血管生成的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)，為腫瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.方法： pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質(zhì)粒通過(guò)LIPOFECTAMINE2000脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HUVECs，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照和空白對(duì)照。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)各組HUVECs中Tie2mRN

15、A及蛋白表達(dá)的改變情況，MTT法（噻唑藍(lán)比色分析法）檢測(cè)HUVECs的生長(zhǎng)曲線變化，顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)。 3.結(jié)果： pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Tie2mRNA表達(dá)低于兩對(duì)照組，而且實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后48h的Tie2mRNA表達(dá)量較24h降低；Tie2蛋白表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照和空白對(duì)照組（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后48h的Tie2蛋白表

16、達(dá)量顯著低于實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后24h（P<0.05）；而凋亡率顯著高于兩對(duì)照組（P<0.05）；生長(zhǎng)曲線顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性較兩對(duì)照組受到明顯抑制（P<0.05）。 全文結(jié)論： （1）胰蛋白酶灌流消化法可獲得大量高純度的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。第Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)證實(shí)了所分離獲得的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。 （2）Tie2在HUVECs中呈高水平表達(dá)。 （3）成功構(gòu)建pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組