RNA干擾酪氨酸激酶受體2對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響.pdf

1、早在1971年，F(xiàn)olkman就提出了腫瘤生長具有血管生成依賴性這一概念，以后陸續(xù)有實驗研究表明，腫瘤連續(xù)性生長必需有血管形成，當實體瘤生長到直徑為2mm時，如繼續(xù)生長，就需要血管供應的保障，瘤細胞可能產生一種腫瘤血管生長因子促進血管內皮細胞的分裂，出現(xiàn)新的毛細血管，進而溝通血流，進入腫瘤組織內，保證瘤組織的氧和營養(yǎng)，同時，新生血管為腫瘤代謝產物的排除提供了途徑，因此，血管生成是腫瘤侵襲性生長、轉移的基礎?？鼓[瘤的血管形成治療，尤其是抗

2、腫瘤的血管形成基因療法、尋找最佳抗腫瘤血管形成的靶位成了當今腫瘤治療研究的一個熱點。 血管內皮細胞在腫瘤血管生成中起著極為重要的作用。機體的血管形成有兩種方式：血管發(fā)生和血管生成。血管發(fā)生是胚胎發(fā)育過程中成血管細胞發(fā)展、形成原始血管的過程，包括內皮細胞分化、增殖、遷移、連接并形成原始血管叢等。血管生成是原始血管叢或已存在的血管經發(fā)芽或其他方式形成新血管的過程，包括內皮細胞降解細胞外基質，并通過趨化移動、增殖，形成新管腔等過程。因

3、此，以血管內皮細胞為靶點的抗血管新生治療已成為腫瘤治療的研究熱點。針對腫瘤血管內皮細胞抗腫瘤血管生成有以下優(yōu)勢：①血管內皮細胞基因組較為穩(wěn)定，針對血管內皮細胞治療不易獲得耐藥；②正常成熟組織毛細血管內皮細胞處于靜止狀態(tài)，而腫瘤血管內皮細胞增殖活躍，出現(xiàn)許多相對特異標記分子，如整合素aVB3、E-選擇素、VEGF受體及Tie，它們的表達較正常靜止內皮細胞高50倍以上，是抗腫瘤血管生成的分子。③從理論上推算一個內皮細胞要飼養(yǎng)50-100個腫

4、瘤細胞，針對血管內皮細胞比直接針對腫瘤細胞治療更為有效。④腫瘤生成血管依賴性是所有腫瘤共有的，理論上適合各種腫瘤。 人臍靜脈內皮細胞具有分化潛能和新生血管內皮細胞的特性，且它對包括炎癥因子在內的多種體內因子均有很好的反應性，與動物血管內皮細胞相比，可使實驗條件和所獲得結果更符合人體情況。因而，人臍靜脈內皮細胞是研究腫瘤血管內皮細胞理想細胞模型。 Tie2是近年來新發(fā)現(xiàn)的除血管內皮細胞生長因子（VEGF）之外的另一參與血

5、管生成調控的主要基因，其是幾乎完全由血管內皮細胞表達的酪氨酸激酶受體，對血管內皮細胞的增殖、水解基底膜、遷移和血管構建的調控作用較強且特異性高。有研究報道缺乏Tie2基因的小鼠往往死于胚胎期的血管發(fā)育障礙，提示Tie2在血管生成中起重要的調節(jié)作用。研究表明，部分對阻斷VEGF途徑無生物反應的腫瘤常表達Tie2，而單獨阻斷Tie2途徑可抑制這一部分的腫瘤生長，提示Tie2和VEGF信號通路是調控腫瘤生長的兩條獨立的途徑。 RNA

6、干擾是特異性基因表達沉默的強有力手段之一，其廣泛存在真核生物中，是生物體在進化上的一種保守的基因組水平的免疫監(jiān)控機制。具有高度特異性、高效率、放大效應并可遺傳的特點。作為一種新的反向遺傳學研究基因功能的方法克服了正向遺傳學中預測性基因功能分析的存在假陽性結論的缺點，這種高通量的基因沉默技術能夠抑制生物體基因組內每一條基因的表達，從整體系統(tǒng)地研究基因的功能及不同基因間的關系。 為了進一步探討Tie2基因對人臍靜脈內皮細胞增殖活性的

7、影響，為后期進行體內抑制腫瘤血管生成的動物實驗研究奠定基礎，為腫瘤的基因治療提供實驗依據，本實驗采用RNA干擾技術，通過陽離子脂質體LIPOFECTAMINE2000介導，將含有針對Tie2的特異性shRNA轉染人臍靜脈內皮細胞HUVECs中。采用實時定量RT-PCR、免疫細胞化學染色及Western blot檢測各組HUVECs中Tie2的mRNA及蛋白表達的改變情況，MTT法檢測HUVECs的生長曲線變化，并在顯微鏡下觀察細胞凋亡情

8、況。 研究內容共分為四章：第一章人臍靜脈內皮細胞的分離純化及鑒定；第二章Tie2在HUVECs中的表達及意義；第三章pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質粒的構建及鑒定；第四章pGenesil1.1-Tie2-shRNA重組質粒干擾HUVECs中Tie2表達及其對HUVECs增殖的影響。 第一章人臍靜脈內皮細胞的分離純化及鑒定。 1.目的： 體外分離培養(yǎng)HUVECs，并鑒定所培養(yǎng)的細胞為

9、血管內皮細胞。 2.方法： 從中山醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產科獲取健康新鮮足月剖宮產胎兒臍帶，以酶消化法獲得HUVECs并進行培養(yǎng)，制備細胞爬片，同時設置陰性對照，經免疫細胞熒光技術鑒定，根據參考相關文獻制定判定標準，證明所培養(yǎng)細胞為血管內皮細胞。 3.結果: 以酶消化法可獲得以HUVECs為主的混合細胞懸液，經反復貼壁法分離純化內皮細胞，Ⅷ因子免疫熒光化學法顯示分離純化所獲得的HUVECs95%以上的細胞

10、胞漿內有熒光表達，證實了所純化的細胞為血管內皮細胞。 第二章 Tie2在HUVECs中的表達及意義。 1.目的： 檢測HUVECs中Tie2 mRNA水平及蛋白表達水平。旨在探討Tie2在體外血管生成中的作用。 2.方法： 收集生長良好的細胞，計數，按Trizol試劑盒說明抽提總RNA，Tie2mRNA的表達按照RT-PCR試劑盒說明書進行。免疫細胞化學染色檢測HUVECs中Tie2蛋白的表達水平

11、：以Tie2兔抗人多克隆抗體為一抗，按SABC免疫組化試劑盒說明進行，DAB顯色。每批次均以PBS代替一抗作陰性對照片一張，以已知Tie2高表達的人臍靜脈內皮細胞株ECV304和博士德公司提供的Tie2陽性片作陽性對照。結果按照Birner等報道的方法進行判定。 3.結果： Tie2基因在體外培養(yǎng)的HUVECs中呈高水平表達。 第三章 pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質粒的構建及鑒定。

12、 1.目的： 構建pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質粒。 2.方法： 在NCBI數據庫中查找Tie2的mRNA全序列，根據shRNA設計原則，設計能編碼Tie2-shRNA的寡核苷酸鏈，交武漢晶賽公司合成。根據pGenesil1.1-U6-shRNA質粒的結構圖，將pGenesil1.1用Eco31Ⅰ酶切使其線性化；將稀釋退火片段與線性化pGenesil-1.1質粒表達載體的連接構建pG

13、enesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質粒；重組質粒經酶切鑒定并測序證實與設計一致。 3.結果： 成功構建pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質粒，經酶切及測序鑒定證實所構建的質粒與設計的完全相符。 第四章 pGenesil1.1-Tie2-shRNA重組質粒干擾HUVECs中Tie2表達及其對HUVECs增殖的影響 1.目的： 探討應用RNA干擾（RNAi）技術沉默

14、Tie2基因，觀察其對人臍靜脈內皮細胞HUVECs增殖活性的影響，為將來進一步進行抑制腫瘤血管生成的動物實驗研究奠定基礎，為腫瘤的基因治療提供實驗依據。 2.方法： pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質粒通過LIPOFECTAMINE2000脂質體介導轉染HUVECs，同時設計陰性對照和空白對照。采用實時定量RT-PCR、免疫細胞化學染色及Western blot檢測各組HUVECs中Tie2mRN

15、A及蛋白表達的改變情況，MTT法（噻唑藍比色分析法）檢測HUVECs的生長曲線變化，顯微鏡下觀察細胞凋亡情況并計算凋亡細胞數。 3.結果： pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組質粒轉染HUVECs后，實驗組細胞中Tie2mRNA表達低于兩對照組，而且實驗組轉染后48h的Tie2mRNA表達量較24h降低；Tie2蛋白表達明顯低于陰性對照和空白對照組（P<0.05），且實驗組轉染后48h的Tie2蛋白表

16、達量顯著低于實驗組轉染后24h（P<0.05）；而凋亡率顯著高于兩對照組（P<0.05）；生長曲線顯示實驗組細胞增殖活性較兩對照組受到明顯抑制（P<0.05）。 全文結論： （1）胰蛋白酶灌流消化法可獲得大量高純度的人臍靜脈內皮細胞。第Ⅷ因子相關抗原檢測證實了所分離獲得的細胞為血管內皮細胞。 （2）Tie2在HUVECs中呈高水平表達。 （3）成功構建pGenesil1.1-U6-Tie2-shRNA重組