Toll樣受體4在小鼠心臟驟停心肺復(fù)蘇后腎損傷中的作用.pdf

1、目的：通過(guò)采用靜脈推注冰氯化鉀（KCL）停跳液致小鼠心臟驟停，然后行心肺腦復(fù)蘇術(shù)，建立心臟驟停心肺復(fù)蘇（CA/CPR）后腎損傷模型，觀察小鼠CA/CPR后腎損傷變化，并通過(guò)檢測(cè)小鼠血清肌酐和尿素氮的變化、腎臟髓過(guò)氧化物酶（MPO）的活性、腎臟Toll樣受體4（TLR4）、細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）和中性粒細(xì)胞趨化因子-2（GRO-β）的蛋白及TLR4mRNA水平的表達(dá)情況，探討TLR4在模型小鼠腎損傷過(guò)程中的作用及可能機(jī)制，以期

2、從炎癥介質(zhì)途徑入手為防治CA/CPR后腎臟損傷提供新的見解，并為臨床復(fù)蘇后防治腎損傷、提高患者存活率提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分，選用C57BL/6小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組（假手術(shù)組）、3min組、5min組、8min組。對(duì)模型組小鼠采用靜脈推注冰氯化鉀停跳液致小鼠心跳驟停，在心跳驟停3min、5min、8min后開始心肺復(fù)蘇（CPR）包括給氧、靜脈推注腎上腺素和胸外按壓進(jìn)行搶救，來(lái)建立心臟驟停心肺復(fù)蘇后腎臟損傷模型

3、。對(duì)假手術(shù)組僅行氣管插管及靜脈置管等CA/CPR前操作，不行CA及CPR操作。第二部分，選取
　　TLR4基因突變小鼠C3H/HeJ小鼠和其野生型C3H/HeN小鼠，隨機(jī)分為：HeJ假手術(shù)組（sham-eJ）、HeN假手術(shù)組（sham-eN）、HeJ模型組（model-eJ）、HeN模型組（model-eN）。采取跟第一部分相同的方法對(duì)模型組實(shí)行CA/CPR，對(duì)假手術(shù)組僅進(jìn)行CA/CPR前操作。在SPF級(jí)動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)72h后取血

4、標(biāo)本，檢測(cè)血清中尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平；取腎臟組織，用來(lái)做超微電鏡檢查和HE染色檢測(cè)腎組織的形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法（western-blot）檢測(cè)小鼠腎臟組織的TLR4、ICAM-1、GRO-β蛋白表達(dá)情況；采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶連鎖反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)TLR4mRNA在小鼠腎臟組織中的表達(dá)變化；ELISA法檢測(cè)各組腎臟組織中髓過(guò)氧化物酶（MPO）的活性。
　　結(jié)果：
　　第一部分，HE染色檢測(cè)結(jié)果顯示，

5、C57小鼠CA/CPR后腎臟組織與假手術(shù)組相比出現(xiàn)明顯改變，腎小球輪廓比較清楚，腎小管上皮細(xì)胞不同程度的出現(xiàn)空泡、滴狀變性，部分上皮細(xì)胞壞死、脫落，基底膜暴露，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分管腔擴(kuò)張，腎小管損傷半定量評(píng)分結(jié)果差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組相比模型組血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）明顯升高。TLR4mRNA及TLR4、ICAM-1及GRO-β蛋白在模型組小鼠腎臟的表達(dá)比假手術(shù)組明顯增加。與假手術(shù)組相比，模型組腎臟組織MPO活

6、性顯著增高。以上變化與心臟驟停時(shí)間呈明顯的正相關(guān)性。
　　第二部分，超微電鏡和HE染色檢測(cè)顯示，HeJ和HeN假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，微絨毛結(jié)構(gòu)和刷狀緣排列緊密，線粒體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，病理改變不明顯，模型組小鼠可見腎小球輪廓比較清晰，腎小管上皮細(xì)胞不同程度的出現(xiàn)了空泡變性，而且部分上皮細(xì)胞壞死、脫落，基底膜暴露，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分管腔擴(kuò)張，腎小管損傷的半定量評(píng)分結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HeN模型組小鼠腎小管損傷程度明顯重于H

7、eJ模型組。超微病理顯示HeN模型組小鼠腎小管上皮細(xì)胞水腫，胞漿淡然疏松，氣球樣變，細(xì)胞核水腫，線粒體可見氣球樣變，遠(yuǎn)曲小管微絨毛脫落。HeJ模型組小鼠比HeN模型組病變輕微，僅有上皮細(xì)胞水腫，空泡樣變性，細(xì)胞核水腫，刷狀緣及微絨毛結(jié)構(gòu)變化不大。模型組小鼠血清BUN和Cr水平明顯高于假手術(shù)組。HeN小鼠模型組與對(duì)照組相比TLR4mRNA及蛋白在腎臟組織表達(dá)明顯增加；ICAM-1和GRO-β蛋白表達(dá)在模型組明顯增高，MPO活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在模

8、型組也明顯增高，而且ICAM-1和GRO-β蛋白表達(dá)及MPO活性在HeJ小鼠腎臟組織升高趨勢(shì)明顯弱于HeN小鼠。
　　結(jié)論：小鼠心臟驟停心肺復(fù)蘇后，出現(xiàn)急性腎損傷，主要由于腎臟缺血再灌注損傷導(dǎo)致小管上皮細(xì)胞損傷，炎癥因子、趨化因子及粘附因子等浸潤(rùn)，共同導(dǎo)致腎臟病理改變；TLR4、ICAM-1、GRO-β表達(dá)及MPO活性在模型組明顯增加。隨著心臟驟停時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)蘇后腎臟形態(tài)學(xué)改變?cè)絿?yán)重，TLR4及其下游基因的表達(dá)及MPO活性也與心