Toll樣受體4在長(zhǎng)春瑞濱致靜脈內(nèi)皮損傷中的作用研究.pdf

1、目的：探討Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)在長(zhǎng)春瑞濱(Vinorelbine，VIN)致靜脈內(nèi)皮損傷中的作用。
　　方法：1.Toll樣受體4在長(zhǎng)春瑞濱致小鼠靜脈炎中的作用研究：取20只BALB/c小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為2組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組按38mg/kg尾靜脈注射3.2 g/L長(zhǎng)春瑞濱；對(duì)照組尾靜脈注射相同體積的生理鹽水(Normal Saline，NS)。于給藥后48h頸椎脫臼處死小

2、鼠，并取近心端距穿刺點(diǎn)1cm處鼠尾組織，4％多聚甲醛中固定后以0.5mol/L乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetra-acetic acid，EDTA)進(jìn)行脫鈣1周，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色后顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)分析；免疫組織化學(xué)染色觀察TLR4在小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。2.Toll樣受體4在長(zhǎng)春瑞濱致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用研究：取長(zhǎng)勢(shì)良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical ven

3、ous endothelial cells，HUVEC)，接種于纖維連接蛋白處理的24孔板或無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為90％-95％時(shí)，加入長(zhǎng)春瑞濱終濃度為0.05mg/L的EGM-2培養(yǎng)基，共同培養(yǎng)1h后，PBS洗滌，換入不含藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0h、6h、12h，以相同培養(yǎng)條件下不加藥物處理的細(xì)胞為空白對(duì)照。利用熒光定量PCR和Western Blot的方法檢測(cè)藥物處理后不同時(shí)間點(diǎn)TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平；同時(shí)利

4、用免疫熒光檢測(cè)藥物處理對(duì)核因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65核轉(zhuǎn)位的影響。
　　結(jié)果：1.組織病理學(xué)：實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈血管出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞脫落、血栓形成和炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變，對(duì)照組小鼠尾靜脈血管無(wú)明顯損傷表現(xiàn)；免疫組織化學(xué)染色：實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)Toll樣受體4(0.273±0.012)，對(duì)照組小鼠尾靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞Toll樣受體4陰性或弱表達(dá)(0.097±0.009)。2

5、.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：0.05mg/L長(zhǎng)春瑞濱干預(yù)1h后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞拉伸，延展，形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，排列紊亂，部分細(xì)胞懸浮脫落。洗去長(zhǎng)春瑞濱換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6h、12h后，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常；熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞TLR4基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)TLR4mRNA表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中干預(yù)1h后升高幅度最大；Western Blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)絀胞TLR4

6、蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)TLR4蛋白表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)TLR4蛋白表達(dá)量遞增；免疫熒光檢測(cè)NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.長(zhǎng)春瑞濱注射小鼠尾靜脈可造成靜脈炎。2.長(zhǎng)春瑞濱上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4蛋白及其mRNA的表達(dá)，促進(jìn)HUVEC NF-κB的活化