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文檔簡介
1、目的:探討Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)在長春瑞濱(Vinorelbine,VIN)致靜脈內皮損傷中的作用。
方法:1.Toll樣受體4在長春瑞濱致小鼠靜脈炎中的作用研究:取20只BALB/c小鼠,按隨機數(shù)字表隨機分為2組,每組10只。實驗組按38mg/kg尾靜脈注射3.2 g/L長春瑞濱;對照組尾靜脈注射相同體積的生理鹽水(Normal Saline,NS)。于給藥后48h頸椎脫臼處死小
2、鼠,并取近心端距穿刺點1cm處鼠尾組織,4%多聚甲醛中固定后以0.5mol/L乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetra-acetic acid,EDTA)進行脫鈣1周,常規(guī)石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅染色后顯微鏡下進行組織學分析;免疫組織化學染色觀察TLR4在小鼠尾靜脈血管內皮細胞的表達。2.Toll樣受體4在長春瑞濱致人臍靜脈內皮細胞損傷中的作用研究:取長勢良好的人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical ven
3、ous endothelial cells,HUVEC),接種于纖維連接蛋白處理的24孔板或無菌培養(yǎng)瓶中,待細胞生長至融合度為90%-95%時,加入長春瑞濱終濃度為0.05mg/L的EGM-2培養(yǎng)基,共同培養(yǎng)1h后,PBS洗滌,換入不含藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0h、6h、12h,以相同培養(yǎng)條件下不加藥物處理的細胞為空白對照。利用熒光定量PCR和Western Blot的方法檢測藥物處理后不同時間點TLR4的mRNA和蛋白表達水平;同時利
4、用免疫熒光檢測藥物處理對核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)p65核轉位的影響。
結果:1.組織病理學:實驗組小鼠尾靜脈血管出現(xiàn)內皮細胞脫落、血栓形成和炎細胞浸潤等病理學改變,對照組小鼠尾靜脈血管無明顯損傷表現(xiàn);免疫組織化學染色:實驗組小鼠尾靜脈血管內皮細胞高表達Toll樣受體4(0.273±0.012),對照組小鼠尾靜脈血管內皮細胞Toll樣受體4陰性或弱表達(0.097±0.009)。2
5、.人臍靜脈內皮細胞形態(tài)學改變:0.05mg/L長春瑞濱干預1h后人臍靜脈內皮細胞拉伸,延展,形態(tài)不規(guī)則,邊界不清,排列紊亂,部分細胞懸浮脫落。洗去長春瑞濱換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6h、12h后,細胞形態(tài)逐漸恢復正常;熒光定量PCR法檢測各組細胞TLR4基因表達水平,結果顯示:與空白對照組相比,各時間點TLR4mRNA表達量均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中干預1h后升高幅度最大;Western Blot檢測各時間點絀胞TLR4
6、蛋白表達水平,結果顯示:與空白對照組相比,各時間點TLR4蛋白表達量均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),隨著時間的增長TLR4蛋白表達量遞增;免疫熒光檢測NF-κB的核轉位情況,結果顯示:與空白對照組相比,各時間點NF-κB p65的核轉位率均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結論:1.長春瑞濱注射小鼠尾靜脈可造成靜脈炎。2.長春瑞濱上調血管內皮細胞TLR4蛋白及其mRNA的表達,促進HUVEC NF-κB的活化
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