新的白血病相關基因CML28的功能研究.pdf

1、目的：
　　 1.研究新的腫瘤相關抗原CML28在白血病細胞系及原代白血病細胞中表達；
　　 2.構建負載CML28腫瘤抗原的樹突狀細胞免疫應答疫苗，誘導特異性針對CML28抗原的細胞免疫應答；靶向沉默SOCS1基因在樹突狀細胞(DC)中的表達，增強CML28樹突狀細胞疫苗的免疫應答功能；
　　 3.靶向沉默CML28/hRrp46p在人慢性髓系白血病細胞系K562細胞中的表達，研究CML28基因表達與K562細

2、胞凋亡與增殖的關系，探討hRrp46p/exosome在K562細胞中的生物學功能。
　　 方法：
　　 1.采用Trizol一步法抽提白血病細胞系以及原代白血病細胞總RNA，反轉錄成cDNA，利用Primer Premier 5.0設計針對CML28的PCR引物CML28-5P CML28-3P，經序列同源性分析，采用RT-PCR檢測、研究CML28 mRNA在白血病細胞的表達，GAPDH作為內參照。
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3、.設計針對CML28基因的特異性克隆引物CML28-5P1CML28-3P1，經BLAST分析，采用RT-PCR從K562細胞中擴增出CML28的cDNA全長；采用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切PCR產物以及真核表達載體pcDNA3.1 HisA后，將酶切后的PCR產物定向克隆至pcDNA3.1 HisA獲得重組載體pcDNA3.1 His-CML28，氨芐青霉素篩選酶切測序鑒定；采用RT-PCR方法CML28-5P2 CML28-3P2，

4、將His-CML28融合蛋白的編碼序列定向克隆至IRES雙表達載體pIRES2-EGFP獲得重組載體pHis-CML28-IRES2-EGFP，卡那霉素篩選陽性克隆，酶切測序鑒定，DH5α擴增純化重組質粒；從健康供體外周血中通過密度梯度離心獲得外周血單個核細胞，采用細胞因子誘導分化培養(yǎng)獲得DC；采用電穿孔方法將pHis-CML28-IRES2-EGFP導入到DC中，以RT-PCR、Western Blotting以及熒光顯微鏡分別檢測C

5、ML28 mRNA、His-CML28融合蛋白、GFP的表達，并評估轉染效率；以CFSE標記未貼壁的同種PBMCs，與轉染后的DC進行混和淋巴細胞培養(yǎng)，采用流式細胞儀(FACS)檢測分析同種反應淋巴細胞的增殖情況，分別選擇不同的白血病細胞系、轉染前后的DC、同種PBMCs以及原代白血病細胞作為靶細胞，以不同的效靶比(E：T)進行CTL細胞殺傷實驗。利用載體介導的RNA干擾技術，采用siRNA Wizard設計靶向SOCS1基因的小分子干

6、擾RNA(siRNA)序列，經BLAST分析，構建靶向沉默SOCS1基因的siRNA表達載體psiRNA-SOCS1；采用電穿孔技術將CML28重組表達載體pHis-CML28-IRES2-EGFP和SOCS1干擾載體psiRNA-SOCS1共轉染至DC中，采用RT-PCR研究檢測siRNA對于SOCS1基因的干擾效率；對照比較干擾SOCS1表達前后，CFSE-MLR中DC對于同種反應淋巴細胞的刺激增殖能力以及效應細胞毒淋巴細胞對于靶細

7、胞殺傷效應的影響，評價沉默SOCS1基因對于CML28樹突狀細胞疫苗的增敏效應。
　　 3.利用siRNA Wizard設計靶向針對CML28/hRrp46p的siRNA靶序列，經BLAST分析后，設計相應發(fā)卡結構及BbsⅠ粘性末端。
　　 siRNA1:Oligo 1：TCC C AA CAC GTC TTC CGT TTC TA T CAA GAG TAG AAA CGG AAG ACG TGT T TT
　　

8、 Oligo 2:CAA AAA AAC AGG TCT TCC GTT TCT A CT CTT GA T AGA AAC GGA AGA CGT GTT；
　　 siRNA2:
　　 Oligo1：TCCC AACA CGTC TTCC GTTT CTACC TTCAAGAGA GGTAG AAAC GGAA GA CC TGTT TT
　　 Oligo2：CAAAA AACA CGTC TTCC GTTT

9、 CTACC TCTCTTGAA GGTAG AAAC GGAA GA CC TGTT；
　　 siRNA 3:
　　 Oligo 1：TCCC AATC GCTG CAGA GGCGTTACT TTCAAGAGA AGT AACGCC TCTGCAGCGATT TT
　　 Oligo 2：CAAAA AATC GCTG CAGA GGCGTTACT TCTCTTGAA AGT AACGCC TCTGCAGCGA

10、TT；
　　 采用DNA連接酶將退火聚合后的siRNA連接到siRNA表達載體，轉化大腸桿菌DH5α，通過藍白篩選獲得陽性克隆并測序鑒定，獲得CML28 特異性siRNA表達載體psiRNA-CML28；通過電穿孔導入到K562細胞中，采用RT-PCR(RT primer:5’-AGCC CAAT CTTC G-3’；CML28 PCR Primer：5’-GCTG CCAG GCGG AAGT GA-3’，5’-CTGT TC

11、GC AGGC AAAG TG-3’)
　　 篩選評價3個干擾載體對于CML28的基因沉默效率；采用CFSE標記K562細胞，F(xiàn)ACS檢測沉默CML28表達后K562細胞的增殖變化情況；采用Annexin-V/PI雙染K562細胞，F(xiàn)ACS檢測CML28沉默后對K562細胞凋亡的影響。
　　 結果：
　　 1.CML28 mRNA在白血病細胞系以及原代白血病細胞中有不同程度的表達，在急性髓系白血病細胞，加速期和急

12、變期的慢性髓系白血病細胞中呈高水平表達，在急性淋巴細胞白血病細胞和慢性髓系白血病慢性期細胞中低水平表達。
　　 2.RT-PCR成功從K562細胞中擴增出CML28 cDNA全長，重組載體pcDNA3.1 His-CML28和pHis-CML28-IRES2-EGFP經酶切及DNA測序鑒定，含有正確的CML28編碼序列；經細胞因子誘導分化培養(yǎng)，PBMCs能成功培養(yǎng)出具有典型形態(tài)特征以及免疫表型特征的DC；經電穿孔導入重組質粒pH

13、is-CML28-IRES2-EGFP后，RT-PCR、Western Blotting分別證實CML28 mRNA以及His-CML28融合蛋白在DC中的表達，熒光倒置顯微鏡檢測到GFP蛋白的表達；不同效靶比進行CFSE-MLR的FACS分析顯示，同種反應淋巴細胞呈現(xiàn)出對應的增殖反應；CTL細胞殺傷實驗結果顯示，MLR獲得的效應細胞能特異性殺傷MHC限制性相合的CML28陽性的靶細胞；RT-PCR檢測顯示，經電穿孔導入psiRNA-S

14、OCS1重組質粒后，SOCS1 mRNA在DC細胞中表達水平呈現(xiàn)出與轉染效率相關的不同程度下調；FACS檢測CFSE-MLR結果顯示，SOCS1表達下調后，同種反應細胞的增殖反應呈現(xiàn)不同程度的增強；CTL殺傷實驗顯示，SOCS1基因表達下調增加了效應細胞對于MHC相合CML28陽性靶細胞的殺傷活性。
　　 3.藍白篩選的陽性克隆經測序鑒定，重組質粒psiRNA-CML28分別含有3個正確的siRNA靶序列；經優(yōu)化電轉轉染條件，經

15、電穿孔導入到K562細胞后，RT-PCR檢測siRNA3導入后，CML28 mRNA水平被明顯下調；Annexin-V/PI雙染FACS檢測K562細胞凋亡顯示CML28表達被下調后K562細胞凋亡增加；CFSE標記的FACS檢測增殖實驗顯示，CML28表達下調后，K562細胞增殖活性減低。
　　 結論：
　　 1.CML28 mRNA在急性髓系白血病，加速期、急變期慢性髓系白血病細胞中均呈現(xiàn)高水平表達，在急性淋巴細胞白

16、血病以及慢性期慢性髓系白血病細胞中低水平表達，是新的白血病相關抗原，從這個意義上，成功誘導CML28特異性的細胞免疫應答將為白血病的過繼免疫治療提供全新的靶點。
　　 2.利用供體PBMCs成功培養(yǎng)出具有典型形態(tài)特征以及免疫表型特征的DC；CML28 樹突狀細胞核酸疫苗能誘導出針對CML28陽性靶細胞的特異性細胞免疫應答；siRNA介導的RNAi促進了DC免疫表型向成熟DC轉變，增強了DC的刺激增殖能力，沉默SOCS1基因能有效

17、增強CML28樹突狀細胞核酸疫苗的殺傷效應。
　　 3.siRNA下調CML28 mRNA在K562細胞中的表達，抑制了K562細胞的增殖，促進了其凋亡，提示CML28/hRrp46p不僅僅是一個腫瘤標志物，更與腫瘤的增殖和凋亡有著重要的聯(lián)系；結合(1)期工作的研究，CML28/hRrp46p作為exosome的一個亞單位，其在白血病細胞中高表達，可能提示exosome在血液腫瘤中的功能亢進狀態(tài)，exosome可能與腫瘤的增殖和