瘦素經(jīng)JAK2-STAT3信號傳導(dǎo)對創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用.pdf

1、創(chuàng)面愈合是外科學(xué)的重要組成部分，各種創(chuàng)傷、燒傷、放射傷及糖尿病等患者創(chuàng)面長期不愈更是臨床常見的棘手問題。燒傷、創(chuàng)傷后創(chuàng)面的愈合過程包括出血、炎癥反應(yīng)、再上皮化等過程，修復(fù)時間長；其中上皮化是創(chuàng)面愈合最重要的過程。創(chuàng)面治療的主要目的就是盡早使創(chuàng)面完成上皮化，從而可減少暴露造成創(chuàng)面感染和肉芽組織過度增生，進(jìn)而愈合后癱痕組織增生。創(chuàng)面愈合進(jìn)程失控對患者功能和外觀的恢復(fù)不利。 表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移最終再上皮化是一個非常復(fù)雜的、動態(tài)

2、有序的生理過程，這個過程由創(chuàng)面環(huán)境釋放的大量細(xì)胞因子所調(diào)控。瘦素是新近發(fā)現(xiàn)的一個16kDa的細(xì)胞因子，最初發(fā)現(xiàn)在脂肪細(xì)胞表達(dá)，由ob基因編碼，在肥胖發(fā)生、體脂信號傳導(dǎo)中有重要作用。近年來瘦素被認(rèn)為在創(chuàng)面愈合過程中可能有重要的促進(jìn)、調(diào)控作用，并且瘦素與促進(jìn)創(chuàng)面愈合的諸多細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)極其相似，為其參與創(chuàng)面愈合提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。瘦素不僅在脂肪組織中合成、分泌到創(chuàng)傷組織，而且皮膚組織受損后傷口組織細(xì)胞也以自分泌或旁分泌的方式合成瘦素，使傷口組織中

3、保持較高的瘦素濃度，這樣有利于創(chuàng)面愈合有關(guān)的生理作用，包括促進(jìn)新生血管生成、調(diào)節(jié)炎癥及免疫功能等。研究表明在傷口組織中的免疫細(xì)胞及修復(fù)細(xì)胞上都有瘦素受體的表達(dá)，而瘦素受體表達(dá)缺失或瘦素一受體信號傳導(dǎo)障礙均導(dǎo)致明顯的創(chuàng)面愈合延遲，同時瘦素一受體信號傳導(dǎo)的激活則可能改善創(chuàng)面愈合。有研究證實瘦素腹腔內(nèi)注射或局部外用顯著促進(jìn)皮膚切割傷小鼠模型的創(chuàng)面愈合。 可見，瘦素應(yīng)用將可能成為促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、加速創(chuàng)面愈合的新策略。瘦素的作用主要

4、由JAK/STAT信號傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)，明確該信號傳導(dǎo)途徑在創(chuàng)面愈合信號傳導(dǎo)中作用，有望促進(jìn)創(chuàng)面愈合的臨床防治。為探討瘦素在表皮缺失創(chuàng)面愈合中的作用及經(jīng)由的跨膜信號傳導(dǎo)途徑，本研究構(gòu)建了瘦素原核表達(dá)載體并在大腸桿菌高效表達(dá)；觀察了瘦素對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響及JAK2/STAT3信號通路的作用；建立了Wister大鼠的深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面模型，在體局部外用瘦素后，觀察大鼠背部表皮缺失創(chuàng)面愈合、再上皮化情況。旨在進(jìn)一步深化創(chuàng)面愈合機(jī)制的認(rèn)識，為其臨

5、床防治提供新思路和治療靶標(biāo)。 第一部分、基因工程高效重組瘦素。 目的：探索一種操作簡單、高效表達(dá)重組國人瘦素的基因工程技術(shù)，為探討瘦素信號系統(tǒng)在各類重要疾病防治中的作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法：依據(jù)瘦素序列，設(shè)計針對瘦素基因的特異性引物。自重瞼手術(shù)時所取眶隔脂肪，經(jīng)RNA提取、RT-PCR制備瘦素目的基因，瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化擴(kuò)增產(chǎn)物。連接至pMD18T載體，得到pMD18T-leptin質(zhì)粒，送上海生工雙向測

6、序并雙酶切鑒定；連接至原核表達(dá)載體pET32a，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE電泳，表達(dá)產(chǎn)物變性、復(fù)性后ELISA檢測抗原反應(yīng)原性。 結(jié)果：提取得到了人脂肪組織總RNA，并保持了良好的完整性。RT-PCR得到500bp左右目的條帶，成功連接到pMD18T、pET32a構(gòu)建pMD18T-leptin、pET32a-leptin，并經(jīng)雙酶切、測序鑒定。誘導(dǎo)培養(yǎng)6h獲得極高效表達(dá)，目的蛋白占總蛋白50%以上，復(fù)性后重組

7、蛋白的抗原反應(yīng)原性得到了明顯提高。 結(jié)論：自重瞼術(shù)所取眶隔脂肪能成功制備瘦素目的基因，并成功構(gòu)建pET32a-leptin原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h獲得極高效表達(dá)，變性、復(fù)性后抗原反應(yīng)原性更高，為瘦素生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究提供了充足的物質(zhì)保障。 第二部分、瘦素經(jīng)JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用。 目的：闡明瘦素對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用，及JAK2/STAT3在介導(dǎo)瘦素信號跨膜傳導(dǎo)中的作用；探討

8、瘦素在創(chuàng)面愈合中的可能作用及機(jī)制，為創(chuàng)面愈合臨床防治提供新策略及靶標(biāo)。 方法：人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)并鑒定。觀察瘦素對角質(zhì)形成細(xì)胞的時間梯度作用，將細(xì)胞隨機(jī)分為六組：瘦素作用24h（L-24h）組、瘦素作用48h（L-48h）組、瘦素作用72h（L-72h）組及三個時間相匹配的對照組，即24h對照（C-24h）組、48h對照（C-48h）組、72h對照（C-72h）組，瘦素作用組為含100ng/ml瘦素的D-KSFM，對照組

9、為不含瘦素的D-KSFM，于相應(yīng)時間點收集細(xì)胞行MTT檢測細(xì)胞增殖；觀察瘦素對角質(zhì)形成細(xì)胞的濃度梯度作用，將細(xì)胞隨機(jī)分為六組：空白對照組、50ng/ml組、100ng/ml組、200ng/ml組、400ng/ml組、800ng/ml組；分別加入含瘦素0、50、100、200、400、800ng/ml的D-KSFM；培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞行MTT、透射電鏡檢測細(xì)胞增殖、凋亡；觀察JAK抑制劑AG490對瘦素促增殖作用的影響，將細(xì)胞隨機(jī)分為四

10、組：空白對照組、瘦素組、AG490組、AG490+瘦素組。分別加入D-KSFM、含100ng/ml瘦素的D-KSFM、含25umol/lAG490的D-KSFM、含25umol/l AG490及100ng/ml瘦素的D-KSFM；培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞行MTT檢測、流式細(xì)胞檢測、CK17免疫細(xì)胞化學(xué)染色、磷酸化STAT3蛋白Western blot檢測。 結(jié)果：作用24h、48h、72h后，瘦素作用組均較對照組有明顯的細(xì)胞增殖，差

11、異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均為p<0．05）。在0-400ng/ml濃度范圍，瘦素干預(yù)組細(xì)胞均較對照組MTT檢測OD值升高，有明顯的細(xì)胞增殖，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0．05）；在800ng/ml濃度，瘦素作用組較對照組細(xì)胞數(shù)更少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0．05）；細(xì)胞凋亡增加。流式細(xì)胞檢測顯示，瘦素組較對照組G0/G1靜止期細(xì)胞比例更低（3．98% vs8．11%）； AG490+瘦素組與瘦素組比較，靜止期細(xì)胞比例增加（4．32% vs3．9

12、8%）。CK17免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘦素組較對照組著色更深、著色細(xì)胞數(shù)更多；而AG490+瘦素組較瘦素組著色更淺、著色細(xì)胞數(shù)更少。Western blot顯示，瘦素組較對照組磷酸化STAT3蛋白表達(dá)增加，AG490+瘦素組較瘦素組表達(dá)減少。 結(jié)論：100ng/ml瘦素對角質(zhì)形成細(xì)胞有時間依賴性促增殖作用。0-400ng/ml濃度范圍內(nèi)，瘦素對角質(zhì)形成細(xì)胞有濃度依賴性促增殖作用，但800ng/ml反而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、增加

13、細(xì)胞凋亡。AG490能有效抑制瘦素對角質(zhì)形成細(xì)胞的促增殖作用，并減少磷酸化STAT3的表達(dá)，提示JAK2/STAT3信號途徑參與瘦素的跨膜信號傳導(dǎo)，阻斷該信號傳導(dǎo)途徑能減少角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。 第三部分、局部應(yīng)用瘦素對大鼠燙傷創(chuàng)面愈合的實驗研究。 目的：建立Wister大鼠的深Ⅱ℃燙傷創(chuàng)面模型，外用瘦素來觀察和研究瘦素在Waster大鼠燙傷創(chuàng)面愈合中的作用和意義，探討瘦素在創(chuàng)傷修復(fù)過程中的作用及其機(jī)制。 方法：選

14、用清潔級Wistar大鼠18只，雌雄不拘，體重220-250g。全身麻醉下用“控時控溫控蒸汽壓燙傷儀”在溫度為108℃，壓力為0．03MPa，時間為4 sec時，在大鼠背部兩側(cè)平行燙四個相同大小和深度的燙傷創(chuàng)面（燙傷后做皮膚病理切片證實為深Ⅱ℃），每個創(chuàng)面面積為1．8cm×2．5cm大小。將所有創(chuàng)面分為兩組，創(chuàng)面涂400ng/ml的瘦素溶液（用PBS釋?。O(shè)為實驗組；每只燙傷大鼠靠近尾部的兩個并排創(chuàng)面，外涂PBS，設(shè)為對照組。每天9：

15、00和18：00各涂一次，實驗為三周。記錄創(chuàng)面完全重上皮化所需要的時間為創(chuàng)面愈合時間；在燙傷后第3，7，11，15，19d 5個時相點測量創(chuàng)面的上皮化率；于傷后第7、14天和21天用手術(shù)刀切取各組的傷口及周邊皮膚，做HE及免疫組化染色（PCNA），以觀察創(chuàng)面的愈合時間和組織形態(tài)以及角質(zhì)形成細(xì)胞在燙傷創(chuàng)面愈合過程增殖和遷移情況。 結(jié)果：創(chuàng)面愈合過程中，對照組肉芽顆粒較粗大，創(chuàng)面出現(xiàn)皮島較晚，創(chuàng)緣上皮爬行慢；而實驗組肉芽略顯細(xì)小，創(chuàng)

16、面出現(xiàn)皮島較早，創(chuàng)緣上皮爬行快。實驗組創(chuàng)面愈合時間快于對照組2-3天左右。平均愈合天數(shù)：對照組為21．3±2．05d，實驗組為18．47±1．52d，實驗組愈合天數(shù)與對照組相比，差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P=0．00）。在燙傷后第19d，實驗組創(chuàng)面愈合率為97．48±1．63，對照組創(chuàng)面愈合率為84．84±2．50，在7、11、15天和19天四個時相點，實驗組愈合率與對照組比較差異均有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P=0．00）。在傷后7、14天和

17、21天創(chuàng)緣組織HE染色可見：實驗組創(chuàng)周表皮反應(yīng)性增生快，表皮層明顯厚于對照組，實驗組創(chuàng)面上皮化過程短于對照組。PCNA免疫組化染色結(jié)果顯示陽性細(xì)胞主要集中于近創(chuàng)緣組織、創(chuàng)面基底部、以及殘留的皮脂腺等皮膚附屬器和新生的肉芽組織和表皮細(xì)胞中，且首先主要表達(dá)在近創(chuàng)緣組織和皮膚基底層中。實驗組在各個時相點PCNA的染色深度比對照組更深、著色細(xì)胞數(shù)量明顯比對照組要多，實驗組燙傷后7d、14d和21d皮膚基底細(xì)胞和上皮細(xì)胞PCNA表達(dá)積分為比較：實