變異鏈球菌cat-pacA-ctxB-DOCK8-DHR融合基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、目的:構(gòu)建含有變異鏈球菌表面蛋白A區(qū)編碼基因pacA和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)催化區(qū)編碼基因cat,佐劑CTB的編碼基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能區(qū)DHR編碼基因的融合基因表達(dá)質(zhì)粒,利用番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8啟動(dòng)融合蛋白的表達(dá),添加柔性肽基因修飾,構(gòu)建穩(wěn)定高效的番茄果實(shí)特異表達(dá)質(zhì)粒,為下一步轉(zhuǎn)化番茄植株提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)共分二部分:
　　第一部分變異鏈球菌cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR融

2、合基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　①設(shè)計(jì)特異引物,通過PCR獲得變異鏈球菌表面蛋白PAC的編碼基因pacA、葡糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 cat、無功能糖基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(DOCK8)的核心功能區(qū) DHR編碼基因;
　?、赥-A克隆構(gòu)建中間載體pMD-cat、pMD-pacA-ctxB、pMD-DOCK8/DHR質(zhì)粒;
　?、勖盖衟MD-cat、pMD-pacA-ctxB、pMD-DOCK8/DHR質(zhì)粒獲得目的基因,通過定向克隆與 pE

3、T32a(+)表達(dá)載體進(jìn)行重組,獲得重組質(zhì)粒pET-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR;
　　第二部分植物表達(dá)質(zhì)粒p2301-E8-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR的構(gòu)建
　　限制性內(nèi)切酶酶切 pET-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR獲得融合基因片段 cat-pacA-ct xB-DOCK8/DHR,經(jīng)定向克隆與植物轉(zhuǎn)化載體 pCAMBIA2301重組,加入從番茄基因組中所提出的番茄果

4、實(shí)特異性啟動(dòng)子E8,獲得植物表達(dá)質(zhì)粒p2301-E8-cat-pacA-ct xB-DOCK8/DHR。
　　結(jié)果:
　　1)構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR經(jīng)KpnI、SalI雙酶切,能得到約4.9kb大小片斷,與預(yù)計(jì)目的基因片斷大小相同,經(jīng)測序證實(shí)插入的方向正確。
　　2)重組質(zhì)粒p2301-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR經(jīng)KpnI、SalI酶切得到約11.6kb