變異鏈球菌F-ATPase及內(nèi)參照啟動(dòng)子熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、致齲菌通過多個(gè)毒力因子在齲病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，其中耐酸是致齲菌最重要的生物學(xué)特征和齲病發(fā)生的前提。只有耐受生物膜的酸性環(huán)境，致齲菌才能生存并持續(xù)代謝和產(chǎn)酸，導(dǎo)致牙體硬組織脫礦與再礦化失衡而引起齲病發(fā)生。質(zhì)子移位膜ATP酶(membrane-bound proton-translocating ATPase，F(xiàn)0F1ATPase，F(xiàn)-ATPase)是致齲菌最重要的耐酸毒力因子，通過將胞內(nèi)氫離子外運(yùn)維持胞內(nèi)相對穩(wěn)定的中性代謝環(huán)境，同時(shí)

2、使細(xì)胞周圍生物膜環(huán)境中酸性物質(zhì)不斷堆積，pn持續(xù)下降直至臨界pH。牙菌斑是生物膜的一種，是病原菌致齲的原位環(huán)境，研究表明致齲菌毒力因子在浮游狀態(tài)與生物膜中的表達(dá)有很大差異性，在生物膜中觀察F-ATPase的表達(dá)能更準(zhǔn)確反應(yīng)致齲菌耐酸因子在齲病發(fā)生過程中的作用機(jī)理，為深入研究齲病的病因?qū)W及預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。目的：本課題以主要致齲菌變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans，變鏈菌)為代表，構(gòu)建變鏈菌(UA159

3、)F-ATPase操縱元啟動(dòng)子啟動(dòng)的綠色熒光蛋白穿梭表達(dá)載體，為原位環(huán)境中研究變鏈菌致齲過程中的耐酸力調(diào)控提供物質(zhì)條件和基礎(chǔ)，同時(shí)為有效監(jiān)控其表達(dá)，我們構(gòu)建以管家基因重組結(jié)合蛋白A(recombination protein A，RecA)操縱元啟動(dòng)子啟動(dòng)的紅色熒光蛋白穿梭載體作為內(nèi)參照，對F-ATPase的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行定量。 方法： 一：構(gòu)建F-ATPase操縱元啟動(dòng)子啟動(dòng)的綠色熒光蛋白穿梭表達(dá)載體 以變鏈菌(

4、UA159)基因序列設(shè)計(jì)并合成F-ATPase操縱元啟動(dòng)子引物，PCR擴(kuò)增并插入到pMD18-T載體測序，確認(rèn)目的片段后經(jīng)該載體將F-ATPase操縱元啟動(dòng)子插入到綠色熒光蛋白表達(dá)載體(pEGFP-N1)，構(gòu)建原核熒光蛋白表達(dá)載體(pFgfp)；從中分離pFgfp中目的片段(F-ATPase操縱元啟動(dòng)子啟動(dòng)的綠色熒光蛋白表達(dá)載體)，連接至穿梭載體(pDL276)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建腸桿菌-鏈球菌熒光蛋白表達(dá)載體。 二：構(gòu)建管家基因R

5、ecA操縱元啟動(dòng)子啟動(dòng)的紅色熒光蛋白穿梭表達(dá)載體 于變鏈菌UA159中擴(kuò)增獲得RecA啟動(dòng)子并測序驗(yàn)證后定向重組至紅色熒光蛋白載體pDSred2-N1中，構(gòu)建熒光蛋白表達(dá)載體(pRred)；分離pRred中目的基因片段定向插入pDL276多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建穿梭表達(dá)載體pLRred。 三：重組載體轉(zhuǎn)化變鏈菌驗(yàn)證 利用基因轉(zhuǎn)化試劑盒將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化變鏈菌并初步驗(yàn)證其表達(dá)。 結(jié)果： (1)pMD18-F

6、中的目的片段測序結(jié)果與變鏈菌基因組進(jìn)行對比，證實(shí)為目的片段—F-ATPase操縱元啟動(dòng)子序列；熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)化菌落觀測及菌落PCR鑒定原核表達(dá)載體pFgfp正確：重組載體(pLFgfp)轉(zhuǎn)化菌落具有綠色熒光，提取菌落中質(zhì)粒雙酶切(EcoR I/Xba I)后電泳分析，目的片段大小相一致，表明pLgFfp構(gòu)建成功。 (2)對插入T載體的片段測序，與UA159全基因組對比，證實(shí)為RecA操縱元啟動(dòng)子序列；插入RecA啟動(dòng)子的pDsR

7、ed2-N1重組載體pRred，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后菌落見紅色熒光，對熒光菌落行PCR鑒定；連接入RecA啟動(dòng)子啟動(dòng)的熒光蛋白編碼片段的重組質(zhì)粒pLRred轉(zhuǎn)化到DH5α中，觀測其成功表達(dá)，熒光菌落質(zhì)粒抽提、酶切、電泳均證實(shí)插入片段與目的片段一致，表明pLRred構(gòu)建成功。 (3)轉(zhuǎn)化有穿梭表達(dá)載體的變鏈菌能在含有kan+的BHI培養(yǎng)基上生長，證實(shí)菌體熒光，表明重組載體可于變鏈菌內(nèi)表達(dá)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建由變鏈菌F-ATP