志賀菌主動(dòng)外排泵acrAB-to1C及調(diào)控基因marOR突變與耐藥的關(guān)系.pdf

1、隨著抗生素的應(yīng)用,志賀菌耐藥現(xiàn)象日益普遍,給細(xì)菌性痢疾的防治工作帶來了一定困難。研究表明細(xì)菌的耐藥機(jī)制涉及多個(gè)方面,其中主動(dòng)外排泵可能起著較重要的作用。本課題組的前期研究已證實(shí)志賀菌中也存在AcrAB-Tolc主動(dòng)外排泵及其調(diào)控基因marOR。在對(duì)acrAB-tolc泵基因的研究中,發(fā)現(xiàn)耐多藥株的acrA mRNA水平明顯高于敏感株,但acrAB-tolC基因突變株與未突變株中,其mRNA水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在對(duì)調(diào)控基因marOR的

2、研究中發(fā)現(xiàn),該基因第1376-1379位點(diǎn)有4個(gè)堿基的缺失存在于志賀菌耐多藥菌株中而不存在于敏感株和參考株中,從而推測(cè)該基因突變可能引起外排泵表達(dá)水平增高,進(jìn)而影響志賀菌的耐藥性。
　　 目的
　　 在前期研究的基礎(chǔ)上,本課題旨在研究志賀菌marOR、acrA、acrB和tolC基因的突變情況,調(diào)控基因marOR的突變對(duì)AcrAB-Tolc主動(dòng)外排泵表達(dá)的影響及其與細(xì)菌耐藥的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1

3、.菌株鑒定:在LB平板上劃線復(fù)蘇志賀菌菌株并重新進(jìn)行血清學(xué)及生化鑒定。
　　 2.藥物敏感試驗(yàn):采用Kinby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法,質(zhì)控菌為ATCC25922。
　　 3.有機(jī)溶劑耐受試驗(yàn):能夠在正己烷與環(huán)己烷比例為3:1的混合溶液中生長(zhǎng)的菌株視為有機(jī)溶劑耐受菌株。
　　 4.志賀菌marOR、acrA、acrB和tolC基因單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析:PCR擴(kuò)增marOR、acrA、acrB和

4、tolC基因,并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,硝酸銀染色,觀察其單鏈構(gòu)象多態(tài)性并照相。
　　 5.核酸序列分析:根據(jù)SSCP分析結(jié)果,選擇11株突變株和1株敏感株、1株參考株進(jìn)行marOR基因測(cè)序。
　　 6.志賀菌acrAB-tolC基因轉(zhuǎn)錄水平分析:利用TRIzol提取志賀菌的總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行第一鏈合成,PCR擴(kuò)增目的片斷,利用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)marOR突變組與未突變組中acrAB-tolC相對(duì)含量

5、。
　　 7.志賀菌株4個(gè)堿基缺失的marOR基因克隆及4個(gè)堿基缺失聯(lián)合3個(gè)點(diǎn)突變的marOR基因克隆:利用重疊延伸PCR擴(kuò)增4個(gè)堿基缺失的marOR基因,與T載體連接后轉(zhuǎn)入DH5a,得到4個(gè)堿基缺失的克隆株；4個(gè)堿基缺失聯(lián)合3個(gè)點(diǎn)突變的克隆株是直接擴(kuò)增具有該突變菌株的marOR基因然后與T載體連接后轉(zhuǎn)入DH5a所得。最后進(jìn)行核酸序列分析進(jìn)行證實(shí)。
　　 8.marOR基因不同突變對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響:檢測(cè)DH5a、轉(zhuǎn)入T

6、載體后的DH5a、完整marOR基因的DH5a克隆株、4個(gè)堿基缺失的DH5a克隆株及4個(gè)堿基缺失聯(lián)合3個(gè)點(diǎn)突變的DH5a克隆株對(duì)多種抗生素的耐藥性,并進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.志賀菌菌株耐藥性檢測(cè):159株志賀菌臨床分離株對(duì)TE、C、AM、GM、NOR和SMZ-TMP等6種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果,敏感株4株,耐單藥株18株,耐多藥株137株,耐多藥率為86.2％。
　　 2.有機(jī)溶劑耐受試驗(yàn):159株志賀菌

7、中有122株對(duì)有機(jī)溶劑耐受,耐受率為76.7％。耐單藥株的有機(jī)溶劑耐受率為83.3％,耐多藥株的有機(jī)溶劑耐受率為75.9％。
　　 3.志賀菌marOR、acrA、acrB和tolC基因單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析:在159株志賀菌臨床分離株中,4株敏感株未發(fā)現(xiàn)marOR、acrA、acrB和tolC基因突變；155株耐藥株中,marOR基因的突變率為17.4％；acrA基因的突變率為5.8％；acrB基因的突變率為3

8、.9％；tolC基因的突變率為2.6％。
　　 4.核酸序列分析:對(duì)參考株、敏感株(Z10)和11株marOR基因突變株的測(cè)序發(fā)現(xiàn),與敏感株和參考株比較,8株突變株均存在1376-1379位點(diǎn)的4個(gè)堿基(CATT)缺失和3處點(diǎn)突變；另外3株耐藥菌株中,菌株200011存在1381-1384位點(diǎn)的4個(gè)堿基(ATTT)缺失和包括以上3處點(diǎn)突變的多處點(diǎn)突變(與敏感株的匹配度僅有86％),菌株Z23存在5處點(diǎn)突變,菌株Z24存在2處點(diǎn)突

9、變。
　　 5.志賀菌acrAB-tolC基因轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果:凝膠成像分析表明,突變組acrA、acrB、tolC表達(dá)的相對(duì)含量明顯高于未突變組acrA、acrB、tolC的相對(duì)含量,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.marOR突變基因克隆:經(jīng)過PCR擴(kuò)增、基因克隆和核酸測(cè)序證實(shí),已成功獲得空載體克隆、無突變marOR基因、4個(gè)堿基缺失突變marOR基因及4個(gè)堿基缺失聯(lián)合3個(gè)點(diǎn)突變marOR基因的克隆,分別記

10、為DH5a(T)、DH5a(marOR),DH5a(marOR-ACTT)、DH5a(marOR-ACTT+3m)。
　　 7.marOR突變對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響:按抑菌環(huán)直徑相差5mm以上為抗生素耐藥性有差別:與DH5a(T)比較,DH5a(marOR-ACTT)對(duì)鏈霉素、妥布霉素、先鋒V、頭孢氨芐的耐藥性增加,DH5a(marOR-ACTT+3m)對(duì)鏈霉素和四環(huán)素的耐藥性增加；與DH5a(marOR)比較,DH5a(marOR

11、-ACTT)和DH5a(marOR-ACTT+3m)對(duì)鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、先鋒V、左氟沙星、環(huán)丙沙星和氟哌酸的耐藥性增加；DH5a(marOR-CATT)與DH5aT(marOR-CATT+3m)相比對(duì)除甲氧芐啶外的實(shí)驗(yàn)所用抗生素的抑菌環(huán)直徑無明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.在志賀菌耐藥菌株中,marOR基因的突變率較高。在檢測(cè)的11株志賀菌耐多藥菌株中,8株marOR基因第1376-1379處有4個(gè)堿基的缺失和