豬胸膜肺炎放線桿菌亞單位成分的制備、免疫原性研究及型特異性間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(PorcinePleuropneumonia)是由胸膜肺炎放線桿菌(ActinobacillusPleuropneumoniae，APP)引起的一種常見的呼吸道傳染病，各年齡的豬只均可感染。豬群感染胸膜肺炎放線桿菌后，當(dāng)遇到氣候環(huán)境突變，通風(fēng)不良等應(yīng)激因素時(shí)，豬只抵抗力下降，可誘發(fā)本病，主要表現(xiàn)為精神沉郁，體溫升高，呼吸困難等臨床癥狀，并出現(xiàn)特征性的出血性肺炎和胸膜炎。本病在世界各養(yǎng)豬國家普遍存在，近年來，流行日趨嚴(yán)重

2、，成為大規(guī)模養(yǎng)豬的五大疫病之一。 本研究共分為四部分： 第一部分：豬胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白的分型及對(duì)小鼠的免疫原性研究 制備1-12個(gè)血清型胸膜肺炎放線桿菌(APP)外膜蛋白(OMP)，通過SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳，將12個(gè)血清型的外膜蛋白分為6個(gè)型，以該外膜蛋白免疫小白鼠，進(jìn)行同源攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果OMP在16μg/只的免疫劑量下可對(duì)小白鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)作用，用同血清型菌株對(duì)免疫后的小白鼠攻毒，僅表現(xiàn)肺臟輕

3、微出血，無死亡，而對(duì)照組未經(jīng)免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡，肺臟嚴(yán)重出血；小白鼠免疫后第2d就可以檢測(cè)到抗體，并且抗體水平上升較快，到第6d抗體達(dá)到最高水平，之后，抗體水平開始下降，但下降幅度不大，可持續(xù)2個(gè)月左右；交叉保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明血清3型和4型OMP對(duì)血清5型APP沒有保護(hù)作用，免疫后的小白鼠攻毒仍表現(xiàn)多數(shù)死亡；其他血清型之間有交叉保護(hù)作用，免疫后的小白鼠攻毒無死亡，僅表現(xiàn)肺臟有不同程度的出血。上述結(jié)果表明OMP是豬傳染性胸膜肺炎病

4、的主要免疫保護(hù)性抗原之一，該研究為APP亞單位疫苗的研制及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。 第二部分：豬胸膜肺炎放線桿菌莢膜多糖的制備及對(duì)小鼠的免疫保護(hù)作用 采用十六烷基溴化銨—無水乙醇法制備血清3型、4型、5型、7型和8型豬胸膜肺炎放線桿菌(APP)英膜多糖(CP)，以該多糖免疫小白鼠，進(jìn)行同源攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果CP在17μg/只的免疫劑量下可對(duì)小白鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)作用，用同血清型菌株對(duì)免疫后的小白鼠攻毒，僅表現(xiàn)肺臟輕微出血，無死

5、亡，而對(duì)照組未經(jīng)免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡，肺臟嚴(yán)重出血；小白鼠免疫后第2d就可以檢測(cè)到抗體，并且抗體水平上升較快，到第6d抗體達(dá)到最高水平，之后，抗體水平開始下降，但下降幅度不大，可持續(xù)2個(gè)月左右；交叉保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明血清3型和4型CP對(duì)血清8型APP沒有保護(hù)作用，免疫后的小白鼠攻毒仍表現(xiàn)多數(shù)死亡；其他血清型之間有交叉保護(hù)作用，免疫后的小白鼠攻毒無死亡，僅表現(xiàn)肺臟有不同程度的出血。上述結(jié)果表明CP是豬傳染性胸膜肺炎病的主要免疫保護(hù)性

6、抗原之一，該研究為APP亞單位疫苗的研制及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。 第三部分：豬胸膜肺炎放線桿菌脂多糖的制備及對(duì)小鼠的免疫保護(hù)作用 采用酚—水法制備血清3型、4型、5型、7型和8型豬胸膜肺炎放線桿菌(APP)脂多糖(LPS)，以該多糖免疫小白鼠，進(jìn)行同源攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果LPS在20μg/只的免疫劑量下可對(duì)小白鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)作用，用同血清型菌株對(duì)免疫后的小白鼠攻毒，僅表現(xiàn)肺臟輕微出血，無死亡，而對(duì)照組未經(jīng)免疫直接攻毒的小白

7、鼠全部死亡，肺臟嚴(yán)重出血；小白鼠免疫后第2d就可以檢測(cè)到抗體，并且抗體水平上升較快，到第6d抗體達(dá)到最高水平，之后，抗體水平開始下降，但下降幅度不大，可持續(xù)2個(gè)月左右；交叉保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明血清3型LPS對(duì)血清5型和7型APP，血清4型LPS對(duì)血清5型和7型APP沒有保護(hù)作用，免疫后的小白鼠攻毒仍表現(xiàn)多數(shù)死亡；其他血清型之間有交叉保護(hù)作用，免疫后的小白鼠攻毒無死亡，僅表現(xiàn)肺臟有不同程度的出血。上述結(jié)果表明LPS是APP的主要免疫保護(hù)性抗原

8、之一，該研究為APP亞單位疫苗的研制及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。 第四部分：型特異性間接ELISA檢測(cè)豬胸膜肺炎放線桿菌抗體 的建立與應(yīng)用 將提純的APP脂多糖作為包被抗原，包被后37℃1h轉(zhuǎn)入4℃過夜包被效果較好；封閉后以37℃1h、血清加入后以37℃1h、酶標(biāo)抗體加入后以37℃1h反應(yīng)，效果較為理想。檢測(cè)攻毒小鼠血清抗體，除發(fā)病后第2d、第3d死亡的2只未檢出抗體外，其余33只至死亡前檢測(cè)結(jié)果全部為陽性，檢出率94