游離的gp190胞內(nèi)功能片段對白血病細(xì)胞的生長調(diào)節(jié).pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文游離的gp190胞內(nèi)功能片段對白血病細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)姓名：王靜申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：人體解剖與組織胚胎學(xué)指導(dǎo)教師：劉厚奇20090501第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文的研究，說明在生理狀態(tài)下7secretase可能發(fā)揮著切割gpl90產(chǎn)生游離C末端的作用。最后我們進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，成功建立了白血病裸鼠動(dòng)物模型。通過對外周血、骨髓和臟器的檢測，說明190CT3移植組在裸鼠體內(nèi)仍然呈現(xiàn)了分化趨勢，侵襲轉(zhuǎn)移的惡性程度降低。因此

2、，通過本課題的研究，我們明確了gpl90C末端不同功能域190CT23、190CT3在細(xì)胞內(nèi)游離存在時(shí)，促進(jìn)白血病細(xì)胞分化，激活信號(hào)分子STAT3；這種游離多肽在生理狀態(tài)下也可能存在。本研究旨在探索受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)單一功能域的應(yīng)用價(jià)值，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞成熟分化。第一部分、重組人gpl90胞內(nèi)功能片段的白血病細(xì)胞株的獲得與鑒定方法：(1)酶切初步鑒定已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA30190C123、pcDNA30190C13，進(jìn)一步測序；構(gòu)建重組質(zhì)

3、粒pcDNA30MUT：通過引物重疊PCR法設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變，在引物中置換突變堿基，將190Cq3蛋白序列中三處YxxQ基團(tuán)的酪氨酸(Y)位點(diǎn)突變?yōu)楸奖彼?F)，將突變后的基因序列插入載體pcDNA30。(2)將重組質(zhì)粒用FuGENE6脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人白血病細(xì)胞株HL60和K562，G418梯度篩選陽性克隆15d，挑選生長旺盛的克隆擴(kuò)增，設(shè)轉(zhuǎn)染pcDNA30空質(zhì)粒載體和野生型HL60和K562細(xì)胞為對照組。鑒定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)gpl90羧基末端(

4、Cterminal)的表達(dá)：用免疫細(xì)胞化學(xué)，蛋白印跡和RTPCR的方法進(jìn)行蛋白水平的半定量檢測，確定穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株，以備后面實(shí)驗(yàn)使用。(3)蘇木精染色，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長曲線；金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞吞噬功能；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面成熟粒單核細(xì)胞相關(guān)抗原的表達(dá)。結(jié)果：(1)BamHI、XbaI雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA30190Cq23、pcDNA30190CT3，電泳紫外燈下觀察可見大小相符的目的片段

5、，測序結(jié)果與Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中LIFR序列(X61615)比對，完全一致。190Cq23全長597個(gè)堿基，190CT3全長357個(gè)堿基。對190CT3定點(diǎn)突變，獲得339bpDNA片段，經(jīng)BamHI、XbaI雙酶切連接重組入質(zhì)粒pcDNA30，雙向測序后與GenbaIll【數(shù)據(jù)庫中LIFR序列(X61615)比對，原190CT3片段的三處編碼酪氨酸的cDNA序列TAT正確置換為編碼苯丙氨酸的TTC，成功獲得重組pcDNA30

6、MUT的真核表達(dá)質(zhì)粒。(2)經(jīng)G418篩選得到重組190CT23、190CT3、MUT的HL60和K562細(xì)胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用免疫印跡法檢測LIFR，于20KD、15KD處見目的蛋白條帶，選取穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。蘇木精染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示190CT23和190CT3誘導(dǎo)后，細(xì)胞的桿狀核與分葉核增加。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分葉核比例：190CT3190Cr23組，P001，組間差別有意義。(3)細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制生長曲線，1