轉(zhuǎn)錄因子Gli1在乳腺癌細(xì)胞從雌激素依賴性向非依賴性轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制.pdf

1、乳腺癌是雌激素依賴性的腫瘤，雌激素可通過雌激素受體-α (EstrogenReceptor-α，ERα)的介導(dǎo)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。阻斷雌激素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的促增殖作用的內(nèi)分泌治療包括使用ER拮抗劑等藥物能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。而乳腺癌細(xì)胞從雌激素依賴性生長轉(zhuǎn)化為非依賴性生長是內(nèi)分泌治療失敗，患者死亡的重要原因。但其發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚。 Hedgehog(Hh)/Gli信號(hào)通路在胚胎發(fā)育中起著極其重要的作用，該通路的

2、異?？稍斐啥喾N先天畸形。越來越多的研究也表明Hh/Gli信號(hào)通路的異常激活會(huì)引起包括前列腺、胰腺、皮膚、小腦和消化道等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Hh信號(hào)通路是通過分泌蛋白Hh與細(xì)胞膜上的受體Patch1蛋白結(jié)合后，解除Patch1對(duì)另一膜蛋白Smoothed(Smo)的抑制，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白家族的表達(dá)和活性，使得信號(hào)最終通過對(duì)靶基因的組織細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)。Hh信號(hào)通路的異常激活引起的腫瘤，都存在有Gl

3、i轉(zhuǎn)錄因子的高水平表達(dá)。但關(guān)于Gli蛋白本身在腫瘤中的作用及其以何種機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的研究尚處于初步研究階段。 Gli蛋白是Hh信號(hào)通路的最下游的轉(zhuǎn)錄因子，其家族在脊椎動(dòng)物中由Gli1、Gli2和Gli3這3種蛋白組成，均可定位于胞質(zhì)和胞核，DNA結(jié)合域由五個(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)所構(gòu)成。Gli1蛋白直接就是轉(zhuǎn)錄激活子，而其本身又僅是Gli家族的靶基因，因而Gli1的mRNA的表達(dá)即是Hh/Gli信號(hào)通路激活的一個(gè)標(biāo)志。在小鼠體內(nèi)誘

4、導(dǎo)過表達(dá)Gli1均可產(chǎn)生基底細(xì)胞癌樣(basalcell carcinoma，BCC)病變。Gli1在許多人類成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、前列腺癌等中高表達(dá)。Gli1的表達(dá)可使低轉(zhuǎn)移性的前腺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)化成高轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞，表明Gli1可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。使用Gli1的siRNA(小片段干擾RNA)阻斷人原代前列腺癌細(xì)胞中的Gli1的表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖已知Hh/Gli通路參與了乳腺的正常發(fā)育，近期有數(shù)篇文獻(xiàn)報(bào)道了乳腺癌組織和細(xì)胞中Hh/Gli通路中

5、通路成員的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在60％以上的癌組織中有Gli1等成員的表達(dá)增多，在部分乳腺癌細(xì)胞株中用環(huán)杷明(cyclopamine)阻斷阻斷該信號(hào)通路的活性，不僅可抑制Gli1表達(dá)，而且還可以抑制細(xì)胞的增殖。目前尚不清楚Gli1本身對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的直接作用，亦沒有發(fā)現(xiàn)Gli1在乳腺癌細(xì)胞向雌激素非依賴性生長轉(zhuǎn)化中作用方面的研究報(bào)道。 為研究Gli1本身對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和進(jìn)展的影響，我們首先觀察了在4株乳腺癌細(xì)胞中Patch1(

6、Hh的受體)和Gli1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Gli1的表達(dá)水平在雌激素非依賴性乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231和MDAMB-435)中遠(yuǎn)高于雌激素依賴性乳腺癌細(xì)胞(MCF-7和T47D)，并且二者的表達(dá)水平與ER的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們作了以下工作： 1．建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)Gli1表達(dá)載體的MCF-7細(xì)胞系，并用實(shí)時(shí)定量RT-PCR(Quantitative Real-time PCR，QRT)的方法從中篩選了兩個(gè)高表達(dá)Gli1的

7、細(xì)胞克隆，其中Gli1-clonel和Gli1-clone2的Gli1的表達(dá)水平分別為空載對(duì)照細(xì)胞(穩(wěn)轉(zhuǎn)了空載體pcDNA3.1的細(xì)胞)的12和6倍。 2．用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期觀察了在沒有雌激素刺激的條件下，Gli1的持續(xù)性過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gli1-MCF-7細(xì)胞的G1期減少，S期增多，細(xì)胞周期進(jìn)程明顯加快。其中Gli1-clonel和Gli1-clone2的S期細(xì)胞的比例分別為與空載對(duì)照細(xì)胞的2.3和1.7

8、倍，表明Gli1的高表達(dá)能明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞雌激素非依賴性增殖。 3．MCF-7細(xì)胞是雌激素依賴性細(xì)胞系，我們進(jìn)一步觀察了在ER激動(dòng)劑或ER拮抗劑處理下，Gli1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和成瘤的影響。實(shí)驗(yàn)顯示，空載體對(duì)照細(xì)胞對(duì)雌激素類試劑的處理有很高的反應(yīng)性，ER激動(dòng)劑能明顯促進(jìn)其增殖，而ER拮抗劑能明顯抑制其增殖；而Gli1高表達(dá)的細(xì)胞對(duì)ER激動(dòng)劑的增殖促進(jìn)和對(duì)ER拮抗劑的增殖抑制的反應(yīng)性明顯減弱。裸鼠實(shí)驗(yàn)中，在補(bǔ)充雌激素條件下，與對(duì)

9、照細(xì)胞相比，Gli1-clonel細(xì)胞在裸鼠中形成的移植瘤體積明顯增大。當(dāng)裸鼠移植瘤長到160mm<'3>時(shí)，停止補(bǔ)充雌激素，給予他莫西芬(TAM)或豆油(空載對(duì)照)皮下注射，之后對(duì)照細(xì)胞pcDNA3.1-MCF-7的移植瘤體積逐漸縮小，而Gli1-clone1移植瘤體積繼續(xù)增大，表明Gli1還可降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療的反應(yīng)性。以上結(jié)果說明Gli1可能參與了乳腺癌細(xì)胞從雌激素依賴性生長向雌激素非依賴性生長的轉(zhuǎn)化和乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治

10、療抵抗的發(fā)生。 4．在探討Gli1減弱MCF-7細(xì)胞對(duì)ER激動(dòng)劑和拮抗劑生長反應(yīng)性的機(jī)制中，我們發(fā)現(xiàn)Gli1持續(xù)性高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞克隆中ERα和PR的表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞相比，分別降低了約50％和70％；用報(bào)告基因方法發(fā)現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)的Gli1可將ERα的轉(zhuǎn)錄活性降低約50％，我們還發(fā)現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)Gli1可以使細(xì)胞NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性升高。 5．我們的實(shí)驗(yàn)還表明MCF-7細(xì)胞中ERα的過表達(dá)能促進(jìn)Gli1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性，表明在乳腺

11、癌細(xì)胞中存在Gli1和ERα的相互作用。 以上結(jié)果表明Gli1表達(dá)增多可以明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞雌激素非依賴性的增殖，并減弱乳腺癌細(xì)胞對(duì)ER激動(dòng)劑和拮抗劑生長反應(yīng)性，提示Gli1在乳腺癌向雌激素非依賴性生長轉(zhuǎn)化和在腫瘤對(duì)內(nèi)分泌治療的抵抗中具有重要作用。Gli1的上述作用可能與其降低ERα和PR表達(dá)、抑制ERα的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，Gli1誘導(dǎo)的NF-κB的活性的增高可能也參與了這個(gè)過程。同時(shí)ERα可促進(jìn)Gli1的表達(dá)和活性，表明在乳腺癌細(xì)