鞘脂在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中脂類組學變化及機制的初步研究.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury，I/R injury),常見于許多臨床病理過程和肝臟手術過程，如失血性休克、肝移植手術、肝葉切除等。再灌注過程中Kupffer細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的活化和氧自由基的產生等引起肝臟組織細胞發(fā)生了一系列代謝、結構和功能的紊亂，從而導致肝細胞的壞死和凋亡。已經(jīng)有大量研究對肝臟缺血再灌注損傷中肝細胞死亡的分子機制進行了探討。但對其機制仍未完全明確，進一步揭示肝臟缺

2、血再灌注中的分子機制仍是目前需要進一步研究的重要課題。 系統(tǒng)生物學(systems biology)是一個嶄新的并且快速發(fā)展的研究領域。它通過對一個細胞或者一個生物體內所有物質分子定量的分析以及這些分子之間相互作用的研究，從而達到從系統(tǒng)水平對于整個生物體或細胞的生物反應的理解。因此，它需要對所有生物物質分子進行高通量的鑒定技術，例如基因組學(genomics)和蛋白組學(proteomics)是分別對DNA/RNA和蛋白質進行高

3、通量的分析的方法。最近，一個新的概念“脂類組學(lipidomics)”被提出，它主要是利用質譜(mass spectrometry，MS)技術對脂類進行高通量的分析。 近年來，研究發(fā)現(xiàn)鞘脂(sphingolipids)及其代謝產物參與調控細胞生長、分化和死亡相關的信號傳導過程。其中神經(jīng)酰胺是公認的在眾多誘導性刺激過程中起關鍵作用的第二信使，在多種肝臟疾病中介導肝細胞的凋亡過程，抑制肝癌的生長。最近也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺參與了肝臟缺血再

4、灌注損傷。然而，由于既往的研究方法缺乏對鞘脂功能研究的足夠重視和在脂類研究中方法學上的不足，目前尚沒有對鞘脂在肝臟疾病中的作用進行系統(tǒng)的研究。脂類組學的出現(xiàn)使得對鞘脂進行系統(tǒng)的分析成為可能。 材料與方法: 健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為2組：1)對照組(control group)，僅作剖腹游離肝鐮狀韌帶及肝十二指腸韌帶，左、中葉肝蒂不行阻斷，(2)缺血再灌注組(I/R組)，建立大鼠70％肝臟缺血再灌注

5、損傷模型，使左、中肝葉缺血缺血45分鐘后，開放左、中葉血流實現(xiàn)再灌注。再灌注后分別與0.5、1、3、6、12小時不同時間點處死大鼠，每個時間點處死5只大鼠，經(jīng)心臟穿刺抽血離心后保存?zhèn)溲錋LT、AST含量測定，取肝左葉組織，經(jīng)行HE染色觀察肝臟組織病理學變化；取左、中葉肝臟組織，稱量濕重。采用經(jīng)典脂類提取方法，提取了冰凍肝臟組織中的鞘脂并保存于-70℃。利用基質輔助激光解離一飛行時間質譜技術(matrix assisted laser

6、desorption ionization-time of flight MS，MALDI-TOF-MS)分析了此模型中肝臟鞘脂全部種類的代謝變化。選取了鞘脂類代謝途徑中的兩個關鍵酶絲氨酸棕櫚酰轉移酶(SPT)和酸性鞘磷脂酶(ASM)進行RT-PCR分析。 結果: 1、再灌注后血清中ALT、AST值與對照組比較均有顯著升高(P＜0.05)。病理表現(xiàn)：對照組組織結構清楚，肝細胞無明顯變性壞死，亦無明顯炎癥細胞浸潤；再灌注后

7、FR組各時點，肝組織結構不清，肝細胞變性壞死明顯，炎癥細胞浸潤數(shù)量多，尤以6小時損傷最為嚴重。 2、質譜結果顯示肝臟組織主要存在三類鞘脂：神經(jīng)酰胺、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺單己糖苷。再灌注后0.5小時幾類鞘脂總量均無明顯改變。神經(jīng)酰胺在再灌注后1小時開始增加(P＜0.05)；再灌注后3，6和12小時，神經(jīng)酰胺和鞘磷脂均明顯增加(P＜0.05)，并伴隨新的峰出現(xiàn)，尤其是在再灌注后6小時出現(xiàn)6種新的分子，分別是(m/z)537.8、583.

8、8、567.7、555.7和683.5、731.4。同時在6小時，還有多種鞘脂達到它們最高豐度，如：(m/z)657.4、701.6、723.5等。除神經(jīng)酰胺和鞘磷脂兩種主要的鞘脂外，我們還檢測到一種神經(jīng)酰胺單己糖苷CMH，(m/z)804.4，其豐度變化趨勢與神經(jīng)酰胺和鞘磷脂的變化一致?？傮w來看，再灌注后鞘脂在總量上是持續(xù)增加的，在6小時達到峰值(P＜0.01)。另外，個別鞘脂在某些時點有所降低，如(m/z)508.9和657.4在1

9、2小時與對照組相比有所降低。對于有顯著改變的峰，根據(jù)浙江大學醫(yī)學院建立的小型的鞘脂類質譜數(shù)據(jù)庫進行了對比，對它們可能的結構進行了推測。 3、對鞘脂代謝中的兩個關鍵酶絲氨酸棕櫚酰轉移酶(SPT)和酸性鞘磷脂酶(ASM)的基因表達情況進行RT-PCR分析，結果顯示SPT和ASM在再灌注后損傷后各時間點的表達與對照相比均無顯著性差異。提示再灌注后鞘脂的代謝可能通過影響關鍵酶的活性來改變鞘脂的代謝。 結論: 一、脂類組學

10、的分析方法基質輔助激光解離-飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS)能有效的分析肝臟組織中各類鞘脂的代謝變化，為脂類組學在肝臟疾病中的研究提供了有力的技術支持。 二、缺血再灌注后，肝臟鞘脂代謝發(fā)生顯著改變，三類鞘脂：神經(jīng)酰胺、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺單己糖苷再灌注后均明顯增加。這三類鞘脂在再灌注后的變化與肝臟損傷程度一致，提示與肝臟缺血再灌注損傷相關。 三、肝臟缺血再灌注后鞘脂代謝的關鍵酶絲氨酸棕櫚酰轉移酶和酸性鞘磷脂酶的基