IL-17A在系統(tǒng)性硬皮病患者血管病變發(fā)病中作用機(jī)制的研究.pdf

1、系統(tǒng)性硬皮病(SSc)是一種系統(tǒng)性自身免疫性結(jié)締組織病，病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，主要表現(xiàn)為皮膚硬化和內(nèi)臟器官纖維化，有較高的致殘率和病死率，SSc至今尚無控制SSc病情發(fā)展和抗纖維化的滿意的治療方法。SSc血管病不僅是該病的早期表現(xiàn)，而且伴隨疾病的整個過程，對該病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后都有非常重要的作用。但迄今為止，SSc患者的血管病的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，對該機(jī)制進(jìn)行研究，猶如對疾病的源頭和早期過程進(jìn)行研究，有利于尋找方法對該病進(jìn)行早期干預(yù)

2、，這對于目前尚無滿意的抗纖維化藥物治療該病的狀況尤為重要。
　　近年來，分泌IL-17的CD4+T細(xì)胞（Th17細(xì)胞）在人類疾病發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來越多的關(guān)注。IL-17A是Th17細(xì)胞分泌的主要致炎因子。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)SSc是一個Th17細(xì)胞相關(guān)的疾病。部分研究推測，SSc患者外周血中IL-17的濃度與病情活動度有相關(guān)性。我們研究發(fā)現(xiàn)，在SSc患者發(fā)病的早期階段，血管周圍浸潤著較多的IL-17+細(xì)胞。于是我們推測，Th1

3、7細(xì)胞可能是參與硬皮病血管病發(fā)病的重要因素。迄今為止，Th17細(xì)胞與SSc發(fā)病的相關(guān)性研究還是初步的，還沒有涉及Th17細(xì)胞與SSc血管病發(fā)病之間關(guān)系的研究。于是本研究以SSc患者和健康對照者的血液標(biāo)本、皮膚組織和培養(yǎng)細(xì)胞為材料，采用ELISA、流式細(xì)胞分析、免疫組織化學(xué)、RT-PCR和Western-Blot等方法，探索了Th17細(xì)胞在SSc患者血管內(nèi)皮損傷、凋亡和膠原合成中的作用和可能的機(jī)制。
　　我們的工作顯示，SSc患者的

4、PBMCs的IL-17A mRNA的表達(dá)較健康對照者明顯增高。同時，SSc患者血清中IL-17A的表達(dá)較健康對照者明顯增高。SSc患者皮膚組織中表皮層、真皮層和皮下組織層中血管周圍都可觀察到IL-17+細(xì)胞的浸潤，健康對照組皮膚各層均未見IL-17+細(xì)胞浸潤。源自于SSc患者血清的IL-17A誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞高水平表達(dá)粘附分子和趨化因子從而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥，并可以招募更多的T淋巴細(xì)胞粘附到血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ERK信號通路可能是參與

5、IL-17A引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥的信號通路之一。原位檢測發(fā)現(xiàn)SSc患者皮膚組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加，同時血管周圍有較多的IL-17+細(xì)胞浸潤。IL-17A體外可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，這種作用可以被IL-17A的中和抗體抑制。IL-17A體外誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞增殖和分泌較高的Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維，IL-17A體外誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞向纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化并表達(dá)α-SMA，ERK信號通路可能參與這種轉(zhuǎn)化。綜上所述，我們的研究提示IL-1

6、7A可能參與SSc患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和凋亡，并誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞向纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而導(dǎo)致膠原合成增加，其在SSc發(fā)病中具有重要作用。
　　第一部分 SSc患者外周血和皮膚組織中IL-17A的表達(dá)
　　目的:探討IL-17A在SSc患者外周血和皮膚組織的變化，探索IL-17A是否與SSc的發(fā)病有關(guān)。
　　方法:用ELISA檢測22例SSc患者和18例健康對照者血清中IL-17A的分泌情況;用熒光定量PCR(real-

7、time PCR)檢測SSc患者和健康對照者外周血PBMCs中IL-17A mRNA的表達(dá)情況;用免疫組化的方法檢測SSc患者和正常對者皮膚組織中IL-17+細(xì)胞的表達(dá)和分布。
　　結(jié)果:22例SSc患者血清中IL-17A（50.58±12.23 pg/ml）較18例健康對照組血清中IL-17A（29.48±5.65pg/ml）表達(dá)明顯增加，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);SSc患者外周血PBMCs中IL-17A mRNA表達(dá)

8、較正常對照組顯著增加，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);SSc患者皮損組織中表皮層、真皮層和皮下組織脂肪小葉間隔中的血管周圍有較多的IL-17+細(xì)胞的浸潤，正常對照者皮膚組織中各層血管周圍均未見IL-17+細(xì)胞的浸潤。
　　結(jié)論:SSc患者外周血和皮膚血管周圍IL-17A的表達(dá)增高可能與SSc患者血管病的發(fā)生有關(guān)。
　　第二部分 SSc患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥與外周血中增高IL-17A關(guān)系的研究
　　目的:探討IL-1

9、7A引起SSc患者血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生機(jī)制。
　　方法:體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)，SSc患者血清和IL-17A體外預(yù)刺激HUVECs和HMEC-1，real-timePCR和Western Blot檢測HUVECs和HMEC-1粘附分子和趨化因子的表達(dá);并采用Western Blot法觀察IL-17A可以激活哪些HUVECs的細(xì)胞信號通路，這些信號通路與HUVECs表達(dá)增加粘

10、附分子和趨化因子的關(guān)系;HUVECs與T細(xì)胞共培養(yǎng)，研究IL-17A預(yù)刺激是否可以誘導(dǎo)T細(xì)胞對HUVECs的粘附。
　　結(jié)果:IL-17A和SSc患者血清可誘導(dǎo)HUVECs和HMEC-1粘附分子VCAM-1、ICAM-1和趨化因子CCL-20和CXCR-4表達(dá)增加，同時可誘導(dǎo)T細(xì)胞對HUVECS的粘附增加;IL-17A可激活HUVECs的MAPK-P38和MAPK-ERK信號通路，其中MAPK-ERK信號通路參與了HUVECs粘附

11、分子和趨化因子表達(dá)的增加，同時MAPK-ERK信號通路誘導(dǎo)了T細(xì)胞對HUVECs的粘附。
　　結(jié)論:在SSc患者血液中IL-17A可能通過ERK信號通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥。
　　第三部分 SSc患者血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與IL-17A的關(guān)系
　　目的:明確IL-17A是否參與SSc患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　方法: TUNEL原位榆測和免疫組化法檢測SSc患者和正常對照者皮膚組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞是否有凋亡增加，以及

12、SSc患者血管周圍IL-17+細(xì)胞浸潤是否增加;IL-17A體外刺激人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，流式細(xì)胞儀檢測刺激前后HUVECs的凋亡是否有增加。IL-17A體外刺激人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，WB法檢測刺激前后HUVECs的凋亡基因caspase-3、抗凋亡基因bcl-2和拮抗促凋亡基因bax的變化。
　　結(jié)果:TUNEL原位染色和免疫組化染色顯示SSc患者皮膚組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯增加，血管周圍有較多

13、IL-17+細(xì)胞浸潤。流式細(xì)胞儀檢測到IL-17A體外刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加WB法檢測發(fā)現(xiàn)凋亡基因caspase-3表達(dá)增加，抗凋亡基因bcl-2和拮抗促凋亡基金bax的表達(dá)呈相反趨勢。IL-17A誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的這種作用可以被IL-17A中和抗體拮抗。
　　結(jié)論:IL-17A可能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡增加。
　　第四部分 SSc患者的皮膚成纖維細(xì)胞膠原合成增加與IL-17A的關(guān)系
　　目

14、的:明確IL-17A是否誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞分泌膠原的增加和向纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
　　方法:從青少年包皮中分離的正常皮膚成纖維細(xì)胞，IL-17A體外刺激皮膚成纖維細(xì)胞，CCK8法檢測IL-17A刺激前后是否可以引起皮膚成纖維細(xì)胞的增殖;ELISA法和WB法檢測IL-17A刺激前后成纖維細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原變化:WB法和細(xì)胞免疫熒光方法檢測α-SMA的表達(dá)變化;WB法檢測IL-17A可以激活哪些成纖維細(xì)胞信號通路，以及信號通

15、路抑制劑對α-SMA表達(dá)的影響;
　　結(jié)果:CCK8法檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度梯度5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml的IL-17A刺激皮膚成纖維細(xì)胞1-4天，可以促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖。ELISA法和Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)，濃度為10ng/ml的IL-17A刺激人皮膚成纖維細(xì)胞24小時，IL-17A可以促進(jìn)其合成Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原增加。IL-17A刺激人皮膚成纖維細(xì)胞3天，可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并特