白頭翁皂苷D抑制人腦膠質(zhì)母細胞瘤U87MG及U251MG生長的實驗研究.pdf

1、近年來天然植物提取物單體在抗腫瘤增殖和促腫瘤凋亡方面取得了一系列進展,以其對正常細胞細胞毒性小,對惡性腫瘤細胞毒性大和促凋亡而備受青睞。白頭翁皂苷D存在于自然界多種植物內(nèi)。本實驗主要針對白頭翁皂苷D對惡性膠質(zhì)母細胞系U87MG和U251MG的生長抑制作用和促凋亡作用及機制展開研究,共分為兩個部分:
　　第一部分:研究在體外白頭翁皂苷 D(Pulsatilla saponin D)對人源性膠質(zhì)母細胞瘤系U87MG及U251MG的生長

2、抑制和促凋亡作用及其主要機制
　　目的:以人腦惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87MG及U251MG為對象,研究白頭翁皂苷D(即盲測試劑太白銀蓮花W-6單體)抑制其生長及致凋亡的作用機理,為治療惡性膠質(zhì)瘤藥物的研究和開發(fā)利用提供進一步的依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用噻唑藍(MTT)比色法研究白頭翁皂苷D對膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用:以正常人靜脈內(nèi)皮細胞系EVC304以及人腦正常星形膠質(zhì)細胞為陽性對照組,U87MG和U251MG作為實

3、驗組,每組中各設(shè)自身陰性對照組;在等比濃度梯度(0.219 nmol/ml、0.438 nmol/ml、0.876 nmol/ml、1.752 nmol/ml、3.504 nmol/ml、7.008 nmol/ml、14.016 nmol/ml and28.032 nmol/ml)下,用白頭翁皂苷D,分別作用于人腦惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87MG及U251MG,在24小時和72小時檢驗其增殖抑制作用。同時求得白頭翁皂苷D對U87MG及U251

4、MG的IC25、IC50及IC75值;以同樣的濃度梯度檢測其對EVC304以及人腦正常星形膠質(zhì)細胞的增殖抑制情況;
　　2.采用流式細胞檢測技術(shù)檢測凋亡作用:在經(jīng)MTT實驗求得IC25、IC50及IC75濃度的基礎(chǔ)上,用白頭翁皂苷D分別作用U87MG和U251MG,經(jīng)12小時和16小時后送檢,檢測細胞的凋亡現(xiàn)象及其細胞周期變化;
　　3.形態(tài)學(xué)觀察凋亡現(xiàn)象:用 IC25、IC50及 IC75濃度的白頭翁皂苷 D分別處理U87

5、MG和U251MG細胞6小時、12小時、24小時后,采用Hoshest33342染色劑浸染15分鐘,觀察細胞核形態(tài)變化;采用TUNEL/PI法,觀察計數(shù)其凋亡情況;對經(jīng)白頭翁皂苷D處理的U87MG和U251MG,采用透射電鏡法,經(jīng)固定、包埋、切片處理后行超微結(jié)構(gòu)觀察;
　　4.生化指標(biāo)檢測:選取凋亡蛋白Caspase家族中的重要成員Caspase-3、Caspase-8,以及其上游的Fas/Fas-L及線粒體Bcl-2/Bax作為

6、檢測指標(biāo),研究相關(guān)蛋白表達水平變化,初步探究其致凋亡機制;檢測自噬特異性抗微管相關(guān)蛋白LC-3表達水平來驗證藥物對腫瘤細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象的誘導(dǎo)作用。
　　5.DNA碎片檢測:按IC50和IC75的濃度,用頭翁皂苷D處理U87MG及U251MG細胞,分別經(jīng)12小時和16小時后,用PBS洗脫,Tris–HCl溶解細胞,20mMEDTA和0.2％ Triton-X100在4℃靜置30min,套管離心,washing-buffer進行洗滌,

7、洗脫液洗脫并提取樣品,后在加有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上進行電泳。
　　結(jié)果:
　　1.MTT實驗后,統(tǒng)計數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷D對人腦惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87MG及U251MG增殖具有顯著的抑制作用;在白頭翁皂苷D濃度為14.016nmol/ml時,對U87MG和U251MG的抑制率分別為87.423%和94.034%(n=6,p<0.05);并求得白頭翁皂苷D對U87MG和U251MG的IC50值分別為7.018nmol/ml和

8、10.132 nmol/ml;而藥物對EVC304和正常膠質(zhì)細胞其生長抑制作用并不顯著;
　　2.經(jīng)FITC-Annexin V/PI染料染色、流式細胞儀檢測后,發(fā)現(xiàn)在不同濃度下用白頭翁皂苷D分別處理U87MG和U251MG12小時和16小時后,早期凋亡和中晚期凋亡呈明顯增加:其中,U87MG的中晚期凋亡率由對照的1.5%增加到57%,其早期凋亡率由0.2%增加到25.8%,凋亡增加顯著;U251MG的同樣增加顯著;周期檢測,U8

9、7MG和U251MG樣品都出現(xiàn)SubG1峰,并呈明顯梯度變化趨勢;且細胞周期阻滯在G0/G1期;
　　3.藥物處理組經(jīng)Hoshest33342染色后,在熒光顯微鏡下,可明顯觀察到處理組細胞核呈新月形、車輪狀等典型凋亡特征,并隨著濃度增高和時間延長,細胞核破碎并呈點狀分布;而對照組和EVC304組未見明顯核型異常;在電鏡下觀察細胞,可見早期凋亡細胞細胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)濃聚和邊集,可形成新月形小體,隨后可見核裂解,有凋亡小體形成,同時我

10、們發(fā)現(xiàn)了疑似自噬小體的存在;經(jīng) TUNEL/PI染色后,可見凋亡細胞呈橘黃色,而未凋亡或者死亡細胞則為紅色;
　　4.在凋亡生化指標(biāo)檢測中,用免疫印跡實驗檢測相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn) Caspase-3、Caspase-8表達隨著藥物作用的時間和濃度的增加而升高,Fas/Fas-L表達也隨之升高,Bcl-2的表達變化降低,Bax表達隨著藥物作用的時間和濃度的變化增加;LC-3Ⅱ/LC-Ⅰ灰度比值隨著藥物濃度的增加顯著升高;
　　5.用

11、DNA ladder法檢測DNA碎片,可見在IC50和IC75組出現(xiàn)典型梯狀條帶,而對照組未見明顯斷裂條帶。
　　第二部分:白頭翁皂苷D(Pulsatilla saponin D)對荷瘤小鼠模型膠質(zhì)瘤生長抑制的作用研究
　　目的:研究在體內(nèi)情況下,白頭翁皂苷D(Pulsatilla saponin D)對于構(gòu)建的膠質(zhì)瘤動物模型中腫瘤的生長抑制和促凋亡作用。
　　方法:
　　1.進行荷瘤載體造模:選擇15g~18g

12、的9只雄性昆明小鼠,以鼠膠質(zhì)細胞瘤細胞系G422行皮下注射進行造模,14天后觀察腫瘤生長情況;檢測體重,按空白組、安慰劑組、給藥組,進行隨機匹配分組;后按體重0.0056mg/g行腹腔注射給藥,7天后進行觀察;相同方案下,選擇3～4周雄性裸鼠以U87MG細胞進行造模,后統(tǒng)計分析;
　　2.用HE染色和TUNEL法檢測給藥處理后腫瘤標(biāo)本,觀察并統(tǒng)計其凋亡情況;并送電鏡檢測其微觀結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果:
　　1.進行荷瘤載體

13、研究,并分析給藥組腫瘤生長情況,發(fā)現(xiàn)給藥組腫瘤平均重量較空白組和安慰劑組均顯著減輕且與給藥濃度成反比;
　　2.經(jīng)藥物處理后的腫瘤經(jīng)HE染色,可見細胞核深染,胞核著色明顯,TUNEL/PI染色后可見明顯黃染區(qū);電鏡可見腫瘤核型明顯濃聚,胞漿皺縮。
　　結(jié)論:
　　1.白頭翁皂苷D明顯對人腦惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87MG及U251MG有抑制增殖作用,且呈時間和濃度依賴;
　　2.體內(nèi)體外實驗證實白頭翁皂苷D對人腦惡性膠