用牙髓干細(xì)胞構(gòu)建牙齒樣結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙髓干細(xì)胞是牙齒組織工程中重要的種子細(xì)胞，自2000年發(fā)現(xiàn)以來(lái)已經(jīng)取得了許多突破性的認(rèn)識(shí)和發(fā)現(xiàn)，但在牙髓干細(xì)胞的進(jìn)一步研究和實(shí)際應(yīng)用中，還有許多問(wèn)題有待認(rèn)識(shí)和解決，例如今后怎樣用它與其它一種或多種細(xì)胞構(gòu)建復(fù)雜牙齒結(jié)構(gòu)的問(wèn)題，怎樣在體外培養(yǎng)中提供合適的微環(huán)境來(lái)誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向特定方向分化的問(wèn)題，尤其是向成牙方向分化的問(wèn)題。本研究首次嘗試將人牙髓干細(xì)胞與異種牙胚上皮細(xì)胞構(gòu)建異種嵌合體牙齒結(jié)構(gòu)、檢測(cè)異種牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)其有何誘導(dǎo)作用以及將

2、牙髓干細(xì)胞與牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合來(lái)嘗試構(gòu)建工程化牙根樣結(jié)構(gòu)，以期為牙髓干細(xì)胞的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為牙髓干細(xì)胞在今后牙齒組織工程的合理使用提供一些有益的提示和參考，并探索出用牙齒來(lái)源干細(xì)胞進(jìn)行牙齒再生的一些新途徑和新方法。
　　所取得的主要結(jié)果如下：
　　一、用牙髓干細(xì)胞制備異種嵌合體牙齒
　　用酶消化法培養(yǎng)了牙髓干細(xì)胞，結(jié)果顯示所培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞形態(tài)典型，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物STRO-1、CD106、CD

3、29，有克隆形成能力，經(jīng)誘導(dǎo)后有成骨和成脂肪細(xì)胞能力，表明我們培養(yǎng)的細(xì)胞是來(lái)源于間充質(zhì)的干細(xì)胞。另外分離獲得豬第三磨牙牙胚并培養(yǎng)牙胚細(xì)胞，用差速消化法純化獲得牙胚上皮細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定顯示其對(duì)CK14、AMBN陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)Vimentin陰性表達(dá)。然后將人牙髓干細(xì)胞和豬的牙胚上皮細(xì)胞以不同方式復(fù)合植入到裸鼠皮下，6周后取材。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分移植物沒(méi)有形成任何有序的結(jié)構(gòu)形態(tài)，但有一部分移植物中形成了含有類(lèi)似牙本質(zhì)、牙髓和牙釉質(zhì)的牙齒樣

4、結(jié)構(gòu)的組織，但是形成這種結(jié)構(gòu)的概率較低。免疫組化結(jié)果證明我們形成的釉質(zhì)樣結(jié)構(gòu)來(lái)源于豬牙胚上皮，而牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)源于人的牙髓干細(xì)胞。
　　本部分結(jié)果表明人的牙髓干細(xì)胞和豬的牙源性上皮細(xì)胞在體內(nèi)，可以模擬類(lèi)似牙胚發(fā)育時(shí)期的上皮-間充質(zhì)相互作用方式，相互誘導(dǎo)，并有可能成功形成異種嵌合體結(jié)構(gòu)。因而我們推斷可見(jiàn)只要進(jìn)一步優(yōu)化條件，用人的牙齒間充質(zhì)干細(xì)胞與異種的牙源性上皮細(xì)胞進(jìn)行異種嵌合在牙齒再生中是有一定可行性的，并將可能成為解決牙釉質(zhì)再生的

5、一條新途徑。
　　二、豬牙胚條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞牙向分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　以前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)人牙胚條件培養(yǎng)基可以為人牙髓干細(xì)胞提供成牙微環(huán)境，誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向成牙方向分化。但由于實(shí)際中應(yīng)用人牙胚條件培養(yǎng)基并不可行，所以本實(shí)驗(yàn)中我們驗(yàn)證了用異種牙胚條件培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞可行性。我們培養(yǎng)發(fā)育期豬的第三磨牙牙胚，并收集獲得牙胚條件培養(yǎng)基，同時(shí)培養(yǎng)人的牙胚并獲得人牙胚條件培養(yǎng)基。將豬和人的牙胚條件培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)人的牙髓干細(xì)

6、胞，并從體內(nèi)、體外比較了豬牙胚條件培養(yǎng)基和人牙胚條件培養(yǎng)基對(duì)人牙髓干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明：人牙髓干細(xì)胞經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的豬牙胚條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，能在細(xì)胞形態(tài)上和細(xì)胞周期上發(fā)生改變，能具有更高的克隆形成能力和多向分化能力，能維持更好的干細(xì)胞特性，具有更強(qiáng)的增殖能力，表達(dá)更高水平的堿性磷酸酶，免疫組化和RT-PCR提示誘導(dǎo)后的牙髓干細(xì)胞能在蛋白水平和基因水平表達(dá)出一些牙向分化的標(biāo)志，如DSP、DSPP、DMP1、BSP、OCN、OPN等。此

7、外，經(jīng)豬牙胚條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)過(guò)的人牙髓干細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)能獲得形狀更為規(guī)則的牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)，而且形成這種規(guī)則結(jié)構(gòu)的概率從20％提高到超過(guò)70％。這些結(jié)果與人牙胚條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的牙髓干細(xì)胞表現(xiàn)類(lèi)似，但常規(guī)培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出特別變化。
　　所得結(jié)果說(shuō)明豬牙胚條件培養(yǎng)基擁有與人牙胚條件培養(yǎng)基一樣的能力，誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞向成牙方向分化。這提示我們異種牙胚條件培養(yǎng)基有可能作為一種牙齒再生的有用工具，我們?cè)诮窈蟮难澜M織工程領(lǐng)

8、域，應(yīng)用異種的牙胚條件培養(yǎng)基將有助于構(gòu)建理想的工程化牙齒。
　　三、用人牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞嘗試構(gòu)建工程化牙根的實(shí)驗(yàn)研究
　　牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞是牙齒再生領(lǐng)域最有潛力的兩個(gè)成體干細(xì)胞，那把這兩種干細(xì)胞一起復(fù)合，能否在體內(nèi)獲得牙根樣結(jié)構(gòu)呢？本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了這方面的初步嘗試。我們體外培養(yǎng)了人牙周膜干細(xì)胞并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示牙周膜干細(xì)胞對(duì)Vimentin染色陽(yáng)性，CK陰性，顯示其為間充質(zhì)來(lái)源，STRO-1呈陽(yáng)性染色

9、，說(shuō)明培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞具有間充質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞的表型特點(diǎn)。成脂、成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了牙周膜干細(xì)胞的多向分化能力與可塑性。本研究中將人的牙髓干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，再與牙周膜干細(xì)胞以不同的方式復(fù)合并植入裸鼠體內(nèi)，希望獲得有一定結(jié)構(gòu)的工程化牙根。結(jié)果顯示：以牙根狀CBB為支架的復(fù)合物取材后肉眼觀呈外形良好的小牙根狀，HE染色表明所有移植物中都有礦化發(fā)生，且能在一部分移植物中發(fā)現(xiàn)有典型Sharpey纖維樣結(jié)構(gòu)。在以CBB顆粒為支架的移植物中，肉眼觀是形

10、成了扁平狀的結(jié)構(gòu)，HE染色結(jié)果顯示也能也有礦化現(xiàn)象發(fā)生，但礦化基質(zhì)較牙根狀CBB為支架的標(biāo)本少。而單純細(xì)胞團(tuán)移植物除小部分出現(xiàn)了一定的礦化現(xiàn)象，大部分不能產(chǎn)生任何的有形結(jié)構(gòu)。在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有典型牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)形成。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們：在構(gòu)建組織工程化牙根中，支架材料最好是有預(yù)成形狀的，以引導(dǎo)相關(guān)干細(xì)胞沿著支架生長(zhǎng)并形成大體結(jié)構(gòu)良好的牙齒樣組織；另外多種細(xì)胞構(gòu)建一定結(jié)構(gòu)時(shí)，不同的種子細(xì)胞最好是分別復(fù)合到支架上