利用牙囊細胞和脂肪間充質干細胞構建組織工程牙周樣結構的研究.pdf

1、牙周組織的再生從本質上講就是牙周發(fā)育過程的再現(xiàn)，因此構建組織工程牙周樣結構必須模擬牙周發(fā)育時的微環(huán)境。牙囊細胞是牙周組織的前體細胞，可以分化為成牙骨質細胞、成纖維細胞和成骨細胞。然而，目前對于牙囊細胞分化的機制還不清楚，對于牙囊細胞能否成為牙周組織工程的種子細胞還不明確。另外，脂肪間充質干細胞具有取材方便、細胞量大、多向分化能力強、免疫源性低等諸多優(yōu)點，已經(jīng)引起了學者們的廣泛關注。那么，這種細胞能否在牙周發(fā)育微環(huán)境的誘導下參與牙周組織的

2、再生？為了回答以上這些問題，本研究擬通過比較牙囊細胞與牙周膜細胞的異同，研究牙囊細胞分化的條件，來更深入地認識這種存在于牙周發(fā)育時期的細胞，探討牙周發(fā)育的微環(huán)境，并將所獲得的結果用來指導以牙囊細胞和脂肪間充質干細胞為種子細胞的工程化牙周組織的構建，為今后的臨床應用奠定基礎。
　　本課題的研究內(nèi)容如下：
　　第一部分：牙囊細胞與牙周膜細胞的比較研究
　　目的：初步比較牙囊細胞和牙周膜細胞的異同。方法：復蘇凍存的第四代人牙

3、囊細胞和人牙周膜細胞，使用倒置顯微鏡進行細胞形態(tài)學觀察，使用流式細胞術檢測兩種細胞的表面分子表達，將細胞與陶瓷骨（CBB）復合，移植入裸鼠皮下，4周、6周后取材，組織學觀察。結果：兩種細胞均為成纖維細胞樣細胞，牙囊細胞胞體稍短，呈不規(guī)則的放射狀排列，牙周膜細胞胞體則更為細長，呈整齊規(guī)則的有序排列。造血系細胞標志CD11b、CD34、CD45在兩種細胞中呈陰性表達；間充質細胞標志CD29、CD44、CD90、CD105在兩種細胞中均高表達

4、；牙周膜細胞CD14表達高于牙囊細胞（6.23％VS.2.72％），牙囊細胞STRO-1表達高于牙周膜細胞（20.99％VS.14.1％），牙囊細胞MACAM/CD146表達明顯高于牙周膜細胞（96.89％VS.17.11％）。兩種細胞與CBB復合后，在裸鼠皮下能夠生成非常相似的組織結構。結論：牙囊細胞與牙周膜細胞具有高度的同源性，兩者均來自外胚間充質細胞；牙囊細胞與牙周膜細胞均含有干細胞成份，牙囊細胞中含有的未分化的間充質干細胞更為豐

5、富；牙囊細胞與牙周膜細胞的分化，需要一定的外部條件進行誘導。
　　第二部分：牙本質非膠原蛋白（dNCPs）對牙囊細胞的影響
　　目的：探討牙本質基質成份是否影響牙囊細胞的增殖與分化。方法：分離、培養(yǎng)出生后6～7dSD仔鼠的牙囊細胞，實驗組細胞用含有250μg/mldNCPs的培養(yǎng)液進行誘導。之后開展一系列的體外實驗，包括細胞形態(tài)學觀察（倒置顯微鏡、掃描電鏡及透射電鏡觀察）、細胞增殖檢測（MTT、BrdU檢測及細胞周期分析）、

6、細胞礦化能力檢測（ALP活性檢測、vonKossa染色）、免疫細胞化學分析、RT-PCR檢測；建立牙囊細胞體內(nèi)分化模型，進行大鼠腎被膜下移植。結果：經(jīng)dNCPs誘導后，牙囊細胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變，增殖受到抑制，礦化能力增強，表達礦化相關的蛋白和基因，呈現(xiàn)成牙骨質細胞特征，在牙本質載體中生成大量的牙骨質樣結構。結論：dNCPs能夠促進牙囊細胞向成牙骨質細胞分化，這一結論補充了牙骨質生成的經(jīng)典理論。
　　第三部分：牙胚根部細胞條件培養(yǎng)

7、液（ATGC-CM）對牙囊細胞的影響
　　目的：探討牙胚根部細胞條件培養(yǎng)液對牙囊細胞增殖與分化的影響。方法：分離培養(yǎng)出生后6～7dSD仔鼠的牙囊細胞，實驗組細胞用ATGC-CM進行誘導。體外實驗包括MTT檢測、流式細胞周期分析、ALP活性檢測、免疫細胞化學分析；體內(nèi)移植實驗利用牙囊細胞體內(nèi)分化模型，進行大鼠腎被膜下移植；移植物進行免疫組化染色。結果：經(jīng)ATGC-CM誘導后，細胞增殖受到抑制，ALP活性增強，表達礦化組織形成細胞和牙

8、周膜成纖維細胞的相關蛋白，在牙本質載體中生成大量的骨樣組織和纖維組織，免疫組化染色確定該礦化組織為骨組織。結論：牙胚根部細胞條件培養(yǎng)液中含有多種與牙根牙周組織發(fā)育相關的生物活性因子；牙胚根部細胞條件培養(yǎng)液可以誘導牙囊細胞向成骨細胞、成纖維細胞分化。
　　第四部分：利用牙囊細胞和脂肪間充質干細胞體內(nèi)異位構建牙周樣結構的研究
　　目的：探討利用牙囊細胞和脂肪間充質干細胞體內(nèi)異位構建牙周樣結構的可行性。方法：用dNCPs和ATGC

9、-CM共同誘導大鼠牙囊細胞，之后將細胞與經(jīng)處理的牙本質塊復合，由新型PLGA纖維膜包裹，移植入大鼠腎被膜下，術后4周、8周取材，組織學觀察；分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠脂肪間充質干細胞；用dNCPs和ATGC-CM共同誘導脂肪間充質干細胞，之后采取三種復合方式：①將脂肪間充質干細胞與CBB復合；②與牙本質塊復合，之后用PLGA膜包裹；③與脫礦骨管腔內(nèi)的牙本質塊復合；移植入大鼠腎被膜下，術后4周、8周取材，進行組織學觀察。結果：經(jīng)誘導后，牙囊細胞

10、在牙本質表面形成牙骨質樣結構，有纖維組織垂直埋入其中，呈現(xiàn)牙骨質/牙周膜樣結構；分離、培養(yǎng)的大鼠脂肪間充質干細胞具有干細胞的特性；經(jīng)誘導后，脂肪間充質干細胞可以在CBB、牙本質塊表面形成牙骨質/牙周膜樣結構，牙本質塊組更為明顯，在靠近脫礦骨一側生成骨樣組織。結論：牙囊細胞在一定的誘導條件下能夠形成牙骨質/牙周膜樣結構；通過異位組織工程的方法進行體內(nèi)構建牙周樣結構是可行的；脂肪間充質干細胞是間充質來源細胞，具有多向分化能力；脂肪間充質干細