纈沙坦與類膜介質(zhì)的相互作用及1型血管緊張素Ⅱ受體的NMR研究.pdf

1、纈沙坦（Valsartan, VST）是一種廣泛應(yīng)用于臨床的抗高血壓藥物，通過選擇性的拮抗1型血管緊張素Ⅱ受體(AT1)達到降壓功效。由于AT1受體的結(jié)構(gòu)尚未得到解析，因此VST雖然療效確切，但是藥物與受體的相互作用機制尚不清楚。目前普遍認為，沙坦類藥物首先滲入細胞膜繼而與膜內(nèi)的AT1受體結(jié)合。在此過程中實際上包含了藥物，生物膜，受體三個對象間復(fù)雜的相互作用。核磁共振的方法(Nuclear Magnetic Resonance, NMR

2、)能夠在原子分子水平上得到分子間相互作用的多種信息，因此本論文中我們以VST為探針，運用NMR方法研究了藥物與膠束類膜體系的相互作用，并且對受體蛋白AT1跨膜區(qū)多肽的樣品制備以及膠束中液體NMR結(jié)構(gòu)的解析進行了初步的探索。
　　研究藥物與膜的相互作用是深入探索沙坦類藥物拮抗機制的第一步。我們利用多種表面活性劑形成的膠束體系模擬生物膜環(huán)境，綜合運用NMR和分子動力學(xué)模擬的方法，研究了VST在到達靶蛋白之前在膜上的滲透過程。我們觀察到

3、在DPC膠束中，VST存在兩種構(gòu)象（反式和順式）NMR時間尺度上的快交換現(xiàn)象。VST質(zhì)子化學(xué)位移，弛豫時間，自擴散系數(shù)的變化反映出兩種構(gòu)象都與DPC存在較強的相互作用。從分子動力學(xué)模擬以及NOESY譜圖中揭示的結(jié)合態(tài)VST的空間結(jié)構(gòu)顯示，VST與DPC的疏水長鏈以及帶正電荷的膽堿頭都存在相互作用，使得VST定位在富含帶電荷親水頭的膠束上層區(qū)域。另外，在DPC膠束中，VST兩種構(gòu)象反式：順式的濃度比為0.94，這一結(jié)果與理論計算顯示的順式

4、相比于反式VST具有較低的DPC結(jié)合自由能相符，反映了兩者與DPC相似的親和能力。在此基礎(chǔ)上，我們比較了CTAB、Tween-20、SDS膠束中VST兩種構(gòu)象的比例（反式：順式），并按照該比例的大小將表面活性劑進行排序，即DPC，CTAB

5、將有助于深入理解沙坦類藥物在生物膜環(huán)境中的傳輸機制并為降壓藥物的設(shè)計提供新的思路。
　　AT1受體屬于GPCR家族，是七次跨膜蛋白，分子量大難以表達，結(jié)構(gòu)迄今無法得到解析。我們通過原核表達和化學(xué)合成等手段對AT1受體的活性片段進行了研究，取得一些探索性結(jié)果。根據(jù)跨膜蛋白的各片段可以單獨形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的理論模型，我們將直接參與相互作用的第五跨膜區(qū)(AT1TM5)多肽作為獨立的結(jié)構(gòu)單元，對其進行原核表達及純化，獲得了高純度、大量表達的融

6、合蛋白。結(jié)果表明，MBP標簽對跨膜多肽的溶解性有明顯改善，并且選擇合適的跨膜區(qū)長度對多肽的表達影響重大。我們根據(jù)氨基酸的親疏水性質(zhì)，設(shè)計并固相合成了第三跨膜區(qū)(AT1TM3)多肽，采集并歸屬了AT1TM3在DPC膠束中的同核二維NMR譜圖。結(jié)果顯示，DPC中AT1TM3多肽NMR信號僅有Leu19-Lys29片段可以分辨，且該片段沒有形成為穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。由此說明，多跨膜區(qū)的獨立折疊模型可能不是普適性的，而且如何選擇合適的表面活性劑仍是