樹突狀細(xì)胞源性exosomes免疫糖尿病LDLr---小鼠抗動脈粥樣硬化作用及其機制研究.pdf

1、研究表明，動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展除了炎癥以及氧化應(yīng)激的致病作用之外，同時存在著機體免疫系統(tǒng)的失衡，表現(xiàn)為一種自身免疫性疾病。而糖尿病作為動脈粥樣硬化的等危征，加重動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展，表現(xiàn)為更為嚴(yán)重的免疫反應(yīng)紊亂。樹突細(xì)胞是經(jīng)典的抗原提呈細(xì)胞，介導(dǎo)了動脈粥樣硬化中的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。而在動脈粥樣硬化的防治中，研究表明AS相關(guān)抗原疫苗的主動免疫，能起到緩解動脈粥樣硬化進(jìn)展的作用，而我們前期的研究表明在糖尿病合并動脈粥樣硬化的LDLr-/-

2、小鼠中，AGE-LDL的主動免疫亦能對其AS病變進(jìn)展起到緩解作用。Exosomes作為亞細(xì)胞機構(gòu)，擁有類似起源細(xì)胞的功能，并且其獨特的生物學(xué)特性使得exosomes有可能克服以往蛋白質(zhì)疫苗以及細(xì)胞疫苗的缺陷，因此其也成為目前疫苗研究的熱點。
　　 研究目的：
　　 本研究旨在研究AGE-LDL主動免疫后小鼠脾臟樹突細(xì)胞源性exosomes是否能作為疫苗，起到緩解糖尿病動脈粥樣硬化病變進(jìn)展的作用以及其可能機制。
　　

3、 研究方法：
　　 (1)選取6周齡LDLr-/-小鼠分成PBS對照組（n=6）以及AGE-LDL免疫組(n=6)，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后給予高脂飲食，于第9周時以25ug劑量AGE-LDL（聯(lián)合氫氧化鋁佐劑）皮下免疫小鼠，等量PBS作為對照，每2周加強免疫一次，共加強3次。第17周，麻醉小鼠后無菌分離脾臟并心臟取血，分離主動脈油紅染色，Elisa測定各小鼠血清AGE-LDL特異性抗體滴度，通過磁珠法分離小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞并

4、進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，AGE-LDL刺激后，抽提兩組樹突細(xì)胞培養(yǎng)上清exosomes，以BCA法測定exosomes蛋白含量，并通過流式對exosomes進(jìn)行鑒定。
　　 (2)選取另一批6周齡LDLr-/-小鼠分成3組，即PBS對照組(n=8)，exo對照組(n=10)，exo免疫組(n=11)，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后開始高脂飲食，第9周時予1ug劑量的exosomes皮下免疫，等量PBS注射作為對照，每2周加強一次，共加強2次。第15周時

5、，所有小鼠腹腔注射STZ(50mg/kg)，連續(xù)注射6日建立糖尿病模型，第25周為實驗終點。處理小鼠后收集血清，通過自動生化儀測定小鼠血脂情況，快速蛋白液相色譜儀測定血清脂蛋白分布。分離小鼠全長主動脈，通過油紅染色觀察不同組小鼠動脈斑塊面積情況;留取小鼠主動脈根部制作冰凍切片，油紅染色觀察根部AS斑塊面積，并通過Masson、MOMA-2染色觀察斑塊的膠原及巨噬細(xì)胞組成評價斑塊穩(wěn)定性。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞免疫表型(Th1

6、/2/17及Treg)的變化，通過血清樣本Elisa檢測三組血清IgG總抗體及AGE—LDL特異性抗體IgG滴度的變化情況。最后通過定量PCR分析脾臟淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)因子的表達(dá)情況。統(tǒng)計學(xué)處理方法:數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 (1)磁珠分選脾臟樹突細(xì)胞，AGE-LDL刺激后CD11c陽性率95.34％，CD86陽性率78.62％，MHC-Ⅱ陽性率83

7、.05％，CD40陽性率82.31％，其分泌的exosomes經(jīng)過流式鑒定，CD63陽性率18.73％，CD11C陽性率9.41％，CD86陽性率為25.79％，MHC-Ⅱ陽性率7.03％，結(jié)果表明得到了樹突細(xì)胞源性的exosomes。
　　 (2)通過AGE-LDL免疫后小鼠樹突細(xì)胞源性exosome的主動免疫，能起到抗動脈粥樣硬化進(jìn)展的作用:小鼠血脂分析示，exo免疫組高密度脂蛋白較exo對照組以及PBS對照組升高有統(tǒng)計學(xué)差

8、異，同時兩注射exosomes組其非高密度脂蛋白較PBS對照組為低;主動脈全長油紅染色示，exo免疫組斑塊面積相較于對照exo組及PBS對照組分別減少44％及54％(p＜0.05)，而exo對照組與PBS對照斑塊面積無明顯差異;主動脈根部冰凍切片油紅染色示，exo免疫組斑塊面積亦較對照exo組及PBS對照組較少達(dá)25％及34％(p＜0.05)，而對照exo組及PBS對照組無明顯差異，三組Masson、MOMA-2染色結(jié)果未見明顯差異，。

9、
　　 (3)通過樹突細(xì)胞源性exosome的主動免疫，能通過免疫調(diào)節(jié)機制起到抗動脈粥樣硬化進(jìn)展的作用:exo免疫組Th1型淋巴細(xì)胞比例較對照exo組及PBS對照組降低(p＜0.05)，exo免疫組及對照exo組Th2型淋巴細(xì)胞比例較PBS對照組增高(p＜0.05)，但exo免疫組及對照exo組間無統(tǒng)計學(xué)差異，三組Th17以及Treg比例無明顯差異。小鼠血清抗體滴度檢測示exo免疫組AGE-LDL特異性抗體滴度相比exo對照組及

10、PBS對照組增高(p＜0.05)，而三組小鼠IgG總抗體滴度水平無明顯差異。qPCR結(jié)果示exo免疫組IFN-γ mRNA表達(dá)量較對照exo組及PBS對照組降低(p＜0.05)，而IDO-1 mRNA表達(dá)量較對照exo組以及PBS對照組升高(p＜0.05)。
　　 研究結(jié)論：
　　 我們的研究表明，主動免疫AGE-LDL之后能發(fā)揮抗動脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。而采用免疫AGE-LDL以后脾臟樹突細(xì)胞源性exosome的主動免