達(dá)格列凈對糖尿病ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、隨著人們生活水平的不斷提高，全世界的2型糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)患病率迅速增多，尤其在發(fā)展中國家更為明顯。與非糖尿病相比，糖尿病患者的心血管疾病（如動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、心肌病等）患病率明顯增高、病情進(jìn)展較快以及多臟器同時(shí)受累[1]。其中動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)為糖尿病患者主要血管并發(fā)癥，其具體機(jī)制目前尚不十分清楚，大多數(shù)專家認(rèn)為其是一種慢性炎癥反應(yīng)[2-4]。動(dòng)脈粥樣硬化將使心肌梗死

2、(Myocardial Infarction，MI)和急性腦卒中的發(fā)生幾率明顯提高[5]。動(dòng)脈粥樣硬化病變在最早期是由于動(dòng)脈內(nèi)膜對炎性細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞的募集，血液循環(huán)中的白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素18（interleukin-18，IL-18）等促炎因子的水平與心血管危險(xiǎn)性呈正相關(guān)。而斑塊中的單核巨噬細(xì)胞是最重要的炎性細(xì)胞，

3、它是先天性免疫系統(tǒng)的原型細(xì)胞，存在于動(dòng)脈粥樣硬化病變的各個(gè)時(shí)期，其釋放的促炎因子有很關(guān)鍵的作用，其中IL-1β和IL-18是最重要的加速動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的促炎癥因子[6]。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)IL-1β和IL-18產(chǎn)生的主要炎性細(xì)胞，其聚集在血管病變部位是啟動(dòng)局部炎癥反應(yīng)和斑塊形成的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物能夠被巨噬細(xì)胞質(zhì)中核苷酸結(jié)合和寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding and oligomerization domai

4、n-like receptors，NLR)感知，NLR與細(xì)胞漿內(nèi)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）及半胱天冬酶-1（caspase-1，Casp-1）形成復(fù)合物促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的成熟，故稱為炎癥小體[7.8]。其中NLRP3是與慢性炎癥反應(yīng)關(guān)系最密切的炎癥小體，能感知體內(nèi)無菌性代謝產(chǎn)物的刺激而活化[9]。NLRP3炎癥小體是目前人們熱衷于研究的一種先天免疫胞內(nèi)模式識(shí)別受體

5、，在固有免疫中起了決定性的作用[10]。當(dāng)配體與NLRP3結(jié)合后促進(jìn)炎癥小體的形成，并活化Casp-1，最終促進(jìn)前白介素1β(pro-interleukin-1β，pro-IL-1β)和前白介素18（pro-interleukin-18，pro-IL-18）的成熟及分泌[11]，產(chǎn)生促炎因子IL-1β和IL-18。大量研究證實(shí)IL-1β和IL-18與動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色[12,13

6、]。
　　鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(sodium glucose co-transporters2，SGLT-2)抑制劑，主要通過抑制腎臟重吸收葡萄糖而達(dá)到降糖的效果。研究發(fā)現(xiàn)，SGLT-2抑制劑能夠降低血清和器官（如肝臟和腎臟）中的如白介素6（interleukin-6，IL-6）、單核細(xì)胞趨化因子1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和TNF-α等炎癥標(biāo)志物，從而降低糖尿病動(dòng)物模型

7、的血管動(dòng)脈硬化度[14，15]。此外，Terami等人給予達(dá)格列凈治療糖尿病小鼠（diabetes mouse，db/db小鼠），發(fā)現(xiàn)治療組巨噬細(xì)胞浸潤、炎癥基因如骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、MCP-1和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表達(dá)均下降。研究還發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈治療抑制了db/db小鼠腎臟的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，延緩糖尿病腎臟的發(fā)生、發(fā)展[16]。因此，我們設(shè)想達(dá)

8、格列凈對糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的形成有抑制作用，并可能與NLRP3炎癥小體活化減少相關(guān)。
　　為驗(yàn)證該假設(shè)，我們用佐鏈菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射載脂蛋白(ApoE)基因敲除(ApoE-/-)小鼠形成糖尿病小鼠，給予高脂飼料喂養(yǎng)，構(gòu)建糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，同時(shí)用達(dá)格列凈或者對照劑進(jìn)行干預(yù)，在體及離體觀察糖脂代謝對炎癥小體活化、動(dòng)脈粥樣硬化形成及NLRP3信號(hào)通路開放，從整體-細(xì)胞水平證明我們的假說。

9、>　　目的：
　　觀察達(dá)格列凈對STZ誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　高脂喂養(yǎng)STZ誘導(dǎo)的DM ApoE-/-小鼠建立實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型;C57BL/6J小鼠為正常組，給予普通飼料。ApoE-/-小鼠給予達(dá)格列凈1mg/kg.d或者對照劑灌胃治療12周后，眼眶取血測血清甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholestero

10、，TCH)、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平;取主動(dòng)脈行油紅O染色(oil red O)分析斑塊面積及脂質(zhì)沉積數(shù)量，蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin，HE)觀察病理形態(tài)變化，酶聯(lián)免疫

11、吸附劑測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測量血清NLRP3，IL-1β和IL-18，免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤情況和斑塊穩(wěn)定性;蛋白質(zhì)印跡(western blot，WB)分析主動(dòng)脈中的NLRP3炎癥小體和促炎因子IL-1β，IL-18的表達(dá)情況。同時(shí)用二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)測定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中活性氧物質(zhì)(

12、reactive oxygen species，ROS)的含量。除此之外，培養(yǎng)野生型(wild type，WT)C57小鼠和NLRP3基因敲出小鼠（NLRP3-/-小鼠）原代巨噬細(xì)胞，給予脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)刺激NLRP3炎癥小體的激活，同時(shí)給予高糖（high glucose，HG）、棕櫚酸(palmitic acid，PA)刺激，用

13、達(dá)格列凈或者對照劑干預(yù)細(xì)胞，觀察炎癥因子IL-1β的變化。
　　結(jié)果：
　　達(dá)格列凈降低了DM小鼠的血糖(p＜0.01)及非糖尿病(non-diabetes mellitus，NDM)ApoE-/-小鼠的血糖(p＜0.05);達(dá)格列凈還減少了DM小鼠的FFA和TG(P＜0.05)水平。HE染色及油紅O結(jié)果顯示，達(dá)格列凈抑制了DM小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成(P＜0.01)，同時(shí)減少了斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積，對NDM小鼠影響不大。此外，達(dá)格

14、列凈降低了DM小鼠血清NLRP3(P＜0.01)，IL-1β(P＜0.05)和IL-18(P＜0.05)的濃度，而在NDM ApoE-/-小鼠中，達(dá)格列凈僅減少了IL-1β濃度(P＜0.05);主動(dòng)脈冰凍切片行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈抑制了DM小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤并降低了平滑肌細(xì)胞的減少，增加了斑塊的穩(wěn)定性;此外，主動(dòng)脈冰凍切片行DHE染色，發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈抑制了DM小鼠ROS的產(chǎn)生;Western blot表明達(dá)格列凈抑制了DM小鼠

15、主動(dòng)脈中NLRP3炎癥小體的表達(dá)，減少了IL-1β、IL-18的生成和釋放，提示該作用可能與ROS的產(chǎn)生減少有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，飽和脂肪酸(PA)和高糖(HG)聯(lián)合刺激能激活巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體，產(chǎn)生促炎因子IL-1β，而達(dá)格列凈干預(yù)后并沒有抑制NLRP3炎癥小體的激活，表明達(dá)格列凈不能直接作用于巨噬細(xì)胞影響NLRP3炎癥小體的激活。此外，用PA和HG刺激NLRP3-/-和WT小鼠的原代巨噬細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)，與WT巨噬細(xì)胞相比