應(yīng)用轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型研究ERCC2-XPD基因多態(tài)與順鉑所致DNA損傷修復(fù)的關(guān)聯(lián).pdf

1、前言
　　惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)生發(fā)展是遺傳和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果，找尋有效的遺傳生物學(xué)標(biāo)志，做到早期預(yù)防和合理治療，對于提高惡性腫瘤的生存率和生存質(zhì)量具有重要意義。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)被稱為第三代遺傳學(xué)標(biāo)記，是指由于單個(gè)堿基替換、缺失或插入等引起的DNA序列改變，從而導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白功能和表型發(fā)生改變。環(huán)境應(yīng)答基因SNP及單體型作為目前復(fù)雜疾

2、病的重要生物學(xué)標(biāo)志，成為腫瘤易感及預(yù)后治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。DNA損傷修復(fù)基因是與惡性腫瘤相關(guān)的首類環(huán)境應(yīng)答基因。
　　順鉑(cisplatin，DDP)是治療卵巢癌、肺癌等實(shí)體瘤的常用藥物。鉑類藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后與DNA結(jié)合，形成Pt-DNA加合物，導(dǎo)致DNA的鏈間或鏈內(nèi)交鏈，引起DNA復(fù)制障礙，從而抑制腫瘤細(xì)胞分裂。然而近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對化療耐藥的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響了化療療效，導(dǎo)致治療預(yù)后并不理想。對鉑類藥物的抵抗可以通過以下機(jī)制

3、發(fā)生:減少藥物積聚;通過共扼結(jié)合去除藥物毒性;提高對鉑類藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA加合物的耐受性;或者提高DNA修復(fù)能力(DNArepaircapacity,DRC)。其中，DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)是導(dǎo)致腫瘤鉑類耐藥的主要原因之一，DNA修復(fù)途徑中的核苷酸切除修復(fù)(NER)、錯(cuò)配修復(fù)(MRR)、堿基切除修復(fù)(BER)等均與鉑類藥物耐藥有關(guān)，而核苷酸切除修復(fù)通路被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)修復(fù)順鉑所致DNA損傷的最主要途徑。
　　核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基

4、因2，又稱著色性干皮病基因D(excisionrepaircrosscomplementationgroup2/XerodermapigmentosumD，ERCC2/XPD)是核苷酸切除修復(fù)通路中的重要基因。ERCC2/XPD基因是一個(gè)多功能的基因，一方面作為解旋酶參與核苷酸切除修復(fù)途徑，在鉑類治療過程中，ERCC2/XPD基因可去除鉑-DNA加合物從而發(fā)揮作用;另一方面其編碼的蛋白還參與組成Ⅱ型轉(zhuǎn)錄因子H(TFⅡH)復(fù)合物及p53介

5、導(dǎo)的凋亡反應(yīng)，同時(shí)還參與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPD參與順鉑(cisplatin，DDP)或卡鉑(carboplatin，CBP)引起的DNA損傷修復(fù)過程。ERCC2/XPD的多態(tài)性可以改變DNA損傷修復(fù)能力，與鉑類藥物的敏感性密切相關(guān)。分子流行病學(xué)研究顯示，ERCC2/XPD751Gln/Gln型多態(tài)性與肺癌、頭頸鱗癌、基底細(xì)胞癌等惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)。在吸煙者和健康人群的研究中，751Gln/Gln型的個(gè)體DRC低，患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)

6、高。751Gln/Gln型的個(gè)體患頭頸部癌的風(fēng)險(xiǎn)亦比Lys/Lys型組高。但以往國內(nèi)也有研究結(jié)果顯示ERCC2/XPDLys751Gln與腫瘤鉑類藥物化療效果并不相關(guān)。這些研究結(jié)果的不同可能與ERCC2/XPD遺傳多態(tài)在人群中分布頻率存在差異有關(guān)。因此，以人群為基礎(chǔ)的流行病學(xué)研究結(jié)果存在的不一致性，提示我們需要標(biāo)化環(huán)境暴露因素，進(jìn)行基因多態(tài)的功能研究。隨著對ERCC2/XPD基因多態(tài)性與鉑類藥物耐藥性關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步研究，將有助于更深入地了

7、解腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制，從而在臨床上為腫瘤的預(yù)防、早期診斷與基因治療提供全新的思路。
　　本研究通過構(gòu)建ERCC2/XPDrs13181AA(Lys751)和ERCC2/XPDrs13181CC(Gln751)兩種基因型的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)ERCC2/XPD缺失的突變型細(xì)胞UV5，獲得穩(wěn)定表達(dá)ERCC2/XPD不同基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。給予順鉑處理后比較不同細(xì)胞的細(xì)胞抑制率及DNA損傷修復(fù)能力的差異;比較磷酸化p53蛋白

8、表達(dá)在順鉑處理后的變化;檢測不同細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率的變化趨勢，進(jìn)而闡明ERCC2/XPD基因多態(tài)性、p53基因表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡與DNA損傷修復(fù)之間的內(nèi)在聯(lián)系。試圖為找尋意義確切的、與鉑類抗腫瘤藥物敏感性相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)AA8(CHO野生型)、UV5(CHO突變型，ERCC2/XPD表達(dá)缺失):90％DMEM+10％F

9、BS，37℃，5％CO2孵育箱培養(yǎng);UV5ERCC2(AA)、UV5ERCC2(CC)、UV5GFP三株轉(zhuǎn)染細(xì)胞:含有0.5-1mg/mlG418的培養(yǎng)基(90％DMEM+10％FBS)，37℃，5％CO2孵育箱培養(yǎng)。
　　2、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定
　　2.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在含0.5-1mg/mlG418的DMEM培養(yǎng)基中選擇生長。在對數(shù)生長期時(shí)，熒光顯微鏡下是否可見表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)染效率。
　　2.2Wester

10、nblotting法檢測ERCC2/XPD基因蛋白表達(dá)。
　　2.3TaqMan(@)real-timePCR法檢測ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)位點(diǎn)基因型。
　　3、各細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力的檢測
　　3.1細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn)(MTT)測定順鉑處理后細(xì)胞存活率;
　　3.2彗星實(shí)驗(yàn)和Rad51免疫熒光實(shí)驗(yàn)測定順鉑所致DNA的損傷情況;
　　4、使用細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測順鉑所致各細(xì)胞周

11、期的改變
　　5、使用AnnexinⅤ-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡率檢測試劑盒檢測順鉑所致各細(xì)胞的凋亡情況
　　6、順鉑致不同細(xì)胞DNA損傷后磷酸化p53的變化
　　6.1Real-timePCR測定順鉑染毒后磷酸化p53mRNA水平;
　　6.2Westernblotting測定順鉑染毒后磷酸化p53蛋白表達(dá)水平;
　　6.3在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上分析比較表達(dá)ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181

12、)位點(diǎn)不同基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間經(jīng)順鉑染毒后誘導(dǎo)磷酸化p53的差異。
　　結(jié)果
　　1、體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的驗(yàn)證
　　1.1ERCC2/XPDrs13181AA(Lys751)、rs13181CC(Gln751)質(zhì)粒以及GFP空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至UV5細(xì)胞，三種轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在含0.5-1mg/mlG418的DMEM培養(yǎng)基中選擇性生長。待穩(wěn)定生長至對數(shù)生長期時(shí)，熒光顯微鏡下檢查轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到80％以上。
　　1.2Weste

13、rnblot鑒定各細(xì)胞中ERCC2/XPD蛋白的表達(dá)，細(xì)胞AA8與轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)可表達(dá)分子量為87kD的ERCC2/XPD蛋白。
　　1.3TaqMan(@)real-timePCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)的ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)位點(diǎn)基因型，分別為AA和CC。
　　2、各細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力差異的比較

14、　　2.1MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ERCC2/XPD缺失型細(xì)胞(UV5和UV5GFP)與野生型AA8相比，對順鉑表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性。而ERCC2/XPD過表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC))則表現(xiàn)出與AA8相似的細(xì)胞抑制率。對于ERCC2/XPD過表達(dá)的兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞在順鉑處理24h時(shí)，8μg/ml與16μg/ml兩個(gè)劑量組，細(xì)胞存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。但是經(jīng)過24h的恢復(fù)，1、2、4、8μg/ml順鉑

15、處理時(shí)，UV5ERCC2(CC)的細(xì)胞存活率低于UV5ERCC2（AA），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.2彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ERCC2/XPD缺失型細(xì)胞(UV5和UV5GFP)與其野生型AA8相比，各濃度、各時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的DNA損傷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。順鉑未經(jīng)處理時(shí)OTM值為高峰，隨順鉑染毒時(shí)間的增加，DNA損傷逐漸加重，當(dāng)處理24h后繼續(xù)培養(yǎng)24h時(shí)，ERCC2/XPD功能完善的細(xì)胞DNA損

16、傷程度得到了明顯的修復(fù)，而ERCC2/XPD缺失的細(xì)胞仍存在一定的損傷情況。轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)對于DNA損傷的修復(fù)能力，在順鉑處理24h后繼續(xù)培養(yǎng)24h時(shí)明顯，但各濃度相比較，差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3Rad51免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)的損傷細(xì)胞比例與野生型AA8接近，僅在8μg/ml順鉑處理24h時(shí)兩轉(zhuǎn)染細(xì)胞間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

17、＜0.05)。順鉑處理24h后繼續(xù)培養(yǎng)24h時(shí)，損傷細(xì)胞的比例相對于24h時(shí)明顯下降，但兩轉(zhuǎn)染細(xì)胞間差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、順鉑致不同細(xì)胞的細(xì)胞周期改變
　　順鉑在腫瘤治療時(shí)常表現(xiàn)細(xì)胞周期的G2、M期阻滯現(xiàn)象。1、2μg/ml順鉑處理各細(xì)胞，可見明顯的細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。隨著順鉑劑量的增加，各細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯越明顯，阻滯的細(xì)胞比例越大，修復(fù)過程越漫長。隨著時(shí)間的延長，各細(xì)胞先集中阻滯于S期，經(jīng)過24h的修復(fù)，野生型AA

18、8與兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)有較明顯的修復(fù)，細(xì)胞集中停留在G2期，但兩者差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、順鉑致不同細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率差異
　　順鉑處理各細(xì)胞，觀察各細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率情況。ERCC2/XPD缺失型細(xì)胞(UV5和UV5GFP)與野生型AA8相比，各濃度、各時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)在同

19、一濃度順鉑處理時(shí)與AA8凋亡率相近，僅在8μg/ml順鉑處理細(xì)胞24h時(shí)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著順鉑處理時(shí)間的延長，各細(xì)胞凋亡率逐漸增加，在順鉑處理24h達(dá)到高峰，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞凋亡率顯著減少，表現(xiàn)出一定的損傷修復(fù)能力。
　　5、順鉑致不同細(xì)胞DNA損傷后磷酸化p53的變化
　　3.1Real-timePCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示順鉑處理24h時(shí)，磷酸化p53的mRNA水平達(dá)到高峰，隨著染毒時(shí)間的延長，磷酸

20、化p53的mRNA水平逐漸呈下降趨勢。在8μg/ml順鉑處理24h時(shí)和處理24h后繼續(xù)培養(yǎng)24h時(shí)，UV5ERCC2(AA)的磷酸化p53mRNA表達(dá)水平明顯高于UV5ERCC2(CC)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　3.2Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示順鉑處理24h時(shí)，ERCC2/XPD的蛋白表達(dá)水平達(dá)到峰值。UV5ERCC2(AA)的磷酸化p53蛋白表達(dá)水平明顯高于UV5ERCC2(CC)，但各濃度、各時(shí)間點(diǎn)未見

21、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論
　　1、本研究通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)SNP在順鉑所致DNA損傷修復(fù)能力方面存在差異，該位點(diǎn)AA基因型轉(zhuǎn)染細(xì)胞的損傷修復(fù)能力優(yōu)于其突變型CC基因型。因此ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)SNP可能通過改變細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力與順鉑耐藥性相關(guān)聯(lián)。
　　2、本研究發(fā)現(xiàn)ERCC2/XPD不但在順鉑所致DNA損傷的核苷酸切除修復(fù)中

22、發(fā)揮重要作用，而且對p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有一定影響。ERCC2/XPDLys751Gln位點(diǎn)AA基因型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中磷酸化p53mRNA水平高于CC基因型。因此推斷ERCC2/XPD基因多態(tài)可能影響p53通路與順鉑耐藥產(chǎn)生一定關(guān)聯(lián)。
　　3、本研究證實(shí)ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)SNP在體外細(xì)胞模型中與順鉑敏感性的關(guān)聯(lián)，提示如能結(jié)合人群研究結(jié)論，該位點(diǎn)可能成為預(yù)測腫瘤患者鉑類藥物治療預(yù)后的一個(gè)有效的生物學(xué)