ERCC1 3’UTR重疊基因CAST沉默及對順鉑所致人肺癌A549細胞DNA損傷修復的影響.pdf

1、前言
　　順鉑是目前應用最廣泛的鉑類抗腫瘤藥物，主要用于治療非小細胞肺癌、小細胞肺癌、睪丸癌（尤其是非精原細胞性）、卵巢癌。目前研究認為，順鉑的抗腫瘤作用主要在于其類似雙功能基烷化劑，DNA是其作用的關鍵靶點。順鉑進入體內后在低氯環(huán)境中氯解離，形成水合陽離子，主要與DNA等生物大分子結合形成共價鍵。DNA上主要的結合位點是G和A的N7，由于順鉑與兩個位點結合，故理論上可以形成鏈內交聯(lián)、鏈間交聯(lián)、DNA-蛋白質分子間交聯(lián)，從而使DN

2、A鏈局部扭結或解旋，阻止DNA聚合酶推進，致使DNA復制、轉錄失敗，造成腫瘤細胞死亡。
　　核苷酸切除修復(NucleotideExcisionRepair,NER)是順鉑所啟動的DNA損傷修復主要途徑之一。在眾多的DNA損傷修復途徑和機制中，NER是DNA損傷修復系統(tǒng)中最重要而靈活的一種，對多種DNA雙螺旋損傷變性，如順鉑、多環(huán)芳烴、紫外線C等環(huán)境致癌因子介導的DNA加合物，NER發(fā)揮主要的切除修復作用。ERCC1基因所編碼的E

3、RCC1蛋白是NER途徑中的重要因子，ERCC1基因位于染色19q13.3，基因全長15×103bp，含10個外顯子，編碼含297個氨基酸的蛋白質，對生命至關重要。ERCC1其表達產物與著色性干皮病互補因子F(XPF)形成緊密的異源二聚體(ERCC1/XPF)，該二聚體是一個特異性的連結5'端的核酸內切酶，具有損傷識別和切除龐大DNA加合物的雙重作用，并且在NER中起到限速作用。
　　1989年VanDuin等人發(fā)現(xiàn)ERCC1非編

4、碼區(qū)域3'末端第10號外顯子與另一基因重疊，存在一個開放閱讀框架(OpenReadingFrame)，從而該重疊基因被命名為CAST(CD3ε-associatedsignaltransducer,CD3EAP)，又稱為ASE-1(即反義ERCC1，AntisenseofERCC1)或PAF49。CAST基因位于19q13.3，基因全長4558bp，含3個外顯子，編碼含512個氨基酸的蛋白質。這種罕見的人類基因重疊屬于反向排列中的會聚型

5、，在酵母、鼠等ERCC1同源體中高度保守，對其生物學意義所知甚少。Vogel等人發(fā)現(xiàn)ERCC1在參與DNA損傷修復及細胞存活的同時，CAST也參與細胞的增殖過程。
　　ERCC1在識別及修復由順鉑所致的加合物起關鍵的作用。盡管國內外相關人士已報道ERCC1mRNA水平及遺傳多態(tài)性與順鉑的耐藥有關，但是對ERCC1引起順鉑耐藥進一步的機制研究所知甚少。而且，由于CAST位于ERCC13'非編碼區(qū)的緣故，故推測可能影響ERCC1的表達

6、。然而，國內外相關報道針對CAST及ERCC1這一重疊基因的關系研究仍是不太清楚，它們在生物體中是彼此促進還是相互抑制不得而知。
　　在本研究中首先通過收集肺癌術中腫瘤標本探討ERCC1、CAST兩基因表達之間及其與個體DNA損傷修復的關聯(lián);并采用RNN沉默和過表達技術，針對靶基因CAST進行沉默并且過表達ERCC1共同瞬時轉染人肺腺癌A549細胞，并檢測CAST基因沉默后對于內外源ERCC1mRNA水平及蛋白表達的影響;及給予順

7、鉑處理后對DNA修復能力的變化。初步探討CAST基因沉默后，對內外源ERCC1mRNA水平及蛋白表達的改變從而探討DNA損傷修復能力是否受到影響？結合前期人群研究試圖闡明CAST基因、ERCC1基因與細胞DNA損傷修復系統(tǒng)的關聯(lián)，及挖掘CAST基因新的功能提供一些新的科學依據(jù)。
　　研究方法
　　1、肺癌組織的收集
　　從2013年10月至11月，收集來自沈陽市中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肺癌術中腫瘤標本15例。填寫簡單調

8、查問卷:記錄人口學特征、既往病史、家族史及生活方式（吸煙、飲酒）等一般狀況。收集肺癌標本類型多為鱗癌和腺癌。告知研究對象并簽署知情同意書后實施研究計劃。一部分用于分析肺癌組織中CAST與ERCC1的關系;另一部分用于原代細胞培養(yǎng)。
　　2、細胞培養(yǎng)及處理
　　原代細胞及人肺腺癌細胞株A549用含10％FBS、10IU/ml青霉素、10IU/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)。施加不同濃度順鉑對其細

9、胞進行處理。
　　3、體外瞬時轉染細胞模型的構建
　　3.1CAST-shRNA質粒及ERCC1-overexpression質粒均由上海吉凱公司設計合成。
　　3.2采用InvitrogenLipofectamine(R)2000轉染試劑盒將CAST-shRNA及ERCC1-overexpression質粒及GFP空質粒分別同時轉染A549細胞。
　　3.3轉染細胞系的鑒定:Real-timePCR檢測CAST

10、基因mRNA水平;Westernblotting分別檢測CAST及外源ERCC1基因蛋白表達。
　　4、CAST基因沉默對內外源性ERCC1表達的影響
　　采用Real-timePCR及Westernblotting分別檢測CAST基因沉默對內外源ERCC1mRNA水平及蛋白表達。
　　5、瞬時轉染細胞DNA損傷修復能力的檢測
　　5.1細胞抑制率實驗(MTT)測定順鉑處理后細胞存活率;
　　5.2彗星實驗

11、測定順鉑所致DNA的損傷情況;
　　結果
　　1、肺癌組織中CAST及ERCC1mRNA表達和順鉑耐藥性檢測
　　15例肺癌術中組織經(jīng)Real-timePCR分析表明CAST與ERCC1表達呈正相關;原代細胞給予順鉑處理后，CAST與ERCC1基因分別與原代肺癌細胞的敏感性呈負相關，即表達量增加伴隨順鉑敏感性下降。
　　2、體外瞬時轉染細胞模型構建成功
　　2.1CAST-shRNA及ERCC1過表達質粒和

12、GFP質粒分別同時轉化感受態(tài)大腸桿菌(E.coliDH5α)，可選擇分別生長于含氨芐和卡那霉素的LB瓊脂平板。對提純的質粒進行測序，CAST及ERCC1序列正確無誤。
　　2.2CAST-shRNA及ERCC1-overexpression質粒及GFP空質粒分別同時轉染A549細胞。各轉染細胞可在24h后熒光顯微鏡下觀察，可見表達綠色熒光蛋白的細胞，確定轉染成功及轉染效率。
　　2.3Real-timePCR篩選高沉默效率的

13、CAST-shRNA，RNAi3為最佳質粒。
　　2.4Westernblotting分別檢測CAST及內外源ERCC1基因蛋白表達，CAST及內源ERCC1分別可表達蛋白分子量為34KD和33KD，外源ERCC1表達蛋白分子量為58KD，證實瞬時細胞轉染成功。
　　3、CAST基因沉默對內外源性ERCC1表達的影響
　　盡管過表達ERCC1，在CAST基因沉默的基礎上，隨著時間的延長，其內外源ERCC1的mRNA水平

14、和蛋白表達與對照組相比均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4、瞬時轉染細胞DNA損傷修復能力的檢測
　　4.1MTT實驗結果顯示在CAST沉默的基礎上，隨著順鉑染毒濃度的增加，轉染細胞的細胞活性均呈下降趨勢，并存在一定的劑量反應關系，表明各濃度順鉑對轉染細胞的細胞活性均有抑制作用，且與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而在CAST-shRNA與ERCC1-overexpression共同瞬時轉染時，在

15、順鉑處理24h后，各濃度的細胞存活率并無明顯的差異，但是經(jīng)過24h的恢復，8μg/ml和128μg/ml兩個濃度的細胞活性均較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.2彗星實驗結果顯示CAST-shRNA與ERCC1-overexpression共同瞬時轉染時，在順鉑處理24h和處理24h后繼續(xù)培養(yǎng)24h兩個時間點，除8μg/ml順鉑處理24h后繼續(xù)培養(yǎng)24h外，其他各濃度相比較，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

16、隨著順鉑濃度的增大，共轉染細胞對表現(xiàn)出較強的敏感性，其產生的DNA鏈間交聯(lián)越嚴重。
　　結論
　　1.位于DNA修復基因ERCC13'UTR的重疊基因CAST與ERCC1表達呈正相關;與順鉑所致肺癌細胞的敏感性呈負相關，即肺癌細胞CAST表達量增加伴隨順鉑敏感性下降。
　　2.本研究發(fā)現(xiàn)CAST沉默后，ERCC1表達受到抑制，同時對順鉑所致的DNA損傷修復能力下降，CAST成為ERCC1基因表達及其發(fā)揮功能重要的共同因