ERCC1 3’UTR重疊基因CAST沉默及對(duì)順鉑所致人肺癌A549細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響.pdf

1、前言
　　順鉑是目前應(yīng)用最廣泛的鉑類(lèi)抗腫瘤藥物，主要用于治療非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、睪丸癌（尤其是非精原細(xì)胞性）、卵巢癌。目前研究認(rèn)為，順鉑的抗腫瘤作用主要在于其類(lèi)似雙功能基烷化劑，DNA是其作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。順鉑進(jìn)入體內(nèi)后在低氯環(huán)境中氯解離，形成水合陽(yáng)離子，主要與DNA等生物大分子結(jié)合形成共價(jià)鍵。DNA上主要的結(jié)合位點(diǎn)是G和A的N7，由于順鉑與兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，故理論上可以形成鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)、DNA-蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)，從而使DN

2、A鏈局部扭結(jié)或解旋，阻止DNA聚合酶推進(jìn)，致使DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄失敗，造成腫瘤細(xì)胞死亡。
　　核苷酸切除修復(fù)(NucleotideExcisionRepair,NER)是順鉑所啟動(dòng)的DNA損傷修復(fù)主要途徑之一。在眾多的DNA損傷修復(fù)途徑和機(jī)制中，NER是DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中最重要而靈活的一種，對(duì)多種DNA雙螺旋損傷變性，如順鉑、多環(huán)芳烴、紫外線C等環(huán)境致癌因子介導(dǎo)的DNA加合物，NER發(fā)揮主要的切除修復(fù)作用。ERCC1基因所編碼的E

3、RCC1蛋白是NER途徑中的重要因子，ERCC1基因位于染色19q13.3，基因全長(zhǎng)15×103bp，含10個(gè)外顯子，編碼含297個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，對(duì)生命至關(guān)重要。ERCC1其表達(dá)產(chǎn)物與著色性干皮病互補(bǔ)因子F(XPF)形成緊密的異源二聚體(ERCC1/XPF)，該二聚體是一個(gè)特異性的連結(jié)5'端的核酸內(nèi)切酶，具有損傷識(shí)別和切除龐大DNA加合物的雙重作用，并且在NER中起到限速作用。
　　1989年VanDuin等人發(fā)現(xiàn)ERCC1非編

4、碼區(qū)域3'末端第10號(hào)外顯子與另一基因重疊，存在一個(gè)開(kāi)放閱讀框架(OpenReadingFrame)，從而該重疊基因被命名為CAST(CD3ε-associatedsignaltransducer,CD3EAP)，又稱(chēng)為ASE-1(即反義ERCC1，AntisenseofERCC1)或PAF49。CAST基因位于19q13.3，基因全長(zhǎng)4558bp，含3個(gè)外顯子，編碼含512個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。這種罕見(jiàn)的人類(lèi)基因重疊屬于反向排列中的會(huì)聚型

5、，在酵母、鼠等ERCC1同源體中高度保守，對(duì)其生物學(xué)意義所知甚少。Vogel等人發(fā)現(xiàn)ERCC1在參與DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞存活的同時(shí)，CAST也參與細(xì)胞的增殖過(guò)程。
　　ERCC1在識(shí)別及修復(fù)由順鉑所致的加合物起關(guān)鍵的作用。盡管?chē)?guó)內(nèi)外相關(guān)人士已報(bào)道ERCC1mRNA水平及遺傳多態(tài)性與順鉑的耐藥有關(guān)，但是對(duì)ERCC1引起順鉑耐藥進(jìn)一步的機(jī)制研究所知甚少。而且，由于CAST位于ERCC13'非編碼區(qū)的緣故，故推測(cè)可能影響ERCC1的表達(dá)

6、。然而，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道針對(duì)CAST及ERCC1這一重疊基因的關(guān)系研究仍是不太清楚，它們?cè)谏矬w中是彼此促進(jìn)還是相互抑制不得而知。
　　在本研究中首先通過(guò)收集肺癌術(shù)中腫瘤標(biāo)本探討ERCC1、CAST兩基因表達(dá)之間及其與個(gè)體DNA損傷修復(fù)的關(guān)聯(lián);并采用RNN沉默和過(guò)表達(dá)技術(shù)，針對(duì)靶基因CAST進(jìn)行沉默并且過(guò)表達(dá)ERCC1共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞，并檢測(cè)CAST基因沉默后對(duì)于內(nèi)外源ERCC1mRNA水平及蛋白表達(dá)的影響;及給予順

7、鉑處理后對(duì)DNA修復(fù)能力的變化。初步探討CAST基因沉默后，對(duì)內(nèi)外源ERCC1mRNA水平及蛋白表達(dá)的改變從而探討DNA損傷修復(fù)能力是否受到影響？結(jié)合前期人群研究試圖闡明CAST基因、ERCC1基因與細(xì)胞DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)，及挖掘CAST基因新的功能提供一些新的科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法
　　1、肺癌組織的收集
　　從2013年10月至11月，收集來(lái)自沈陽(yáng)市中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肺癌術(shù)中腫瘤標(biāo)本15例。填寫(xiě)簡(jiǎn)單調(diào)

8、查問(wèn)卷:記錄人口學(xué)特征、既往病史、家族史及生活方式（吸煙、飲酒）等一般狀況。收集肺癌標(biāo)本類(lèi)型多為鱗癌和腺癌。告知研究對(duì)象并簽署知情同意書(shū)后實(shí)施研究計(jì)劃。一部分用于分析肺癌組織中CAST與ERCC1的關(guān)系;另一部分用于原代細(xì)胞培養(yǎng)。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　原代細(xì)胞及人肺腺癌細(xì)胞株A549用含10％FBS、10IU/ml青霉素、10IU/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5％CO2孵育箱中培養(yǎng)。施加不同濃度順鉑對(duì)其細(xì)

9、胞進(jìn)行處理。
　　3、體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的構(gòu)建
　　3.1CAST-shRNA質(zhì)粒及ERCC1-overexpression質(zhì)粒均由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)合成。
　　3.2采用InvitrogenLipofectamine(R)2000轉(zhuǎn)染試劑盒將CAST-shRNA及ERCC1-overexpression質(zhì)粒及GFP空質(zhì)粒分別同時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。
　　3.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的鑒定:Real-timePCR檢測(cè)CAST

10、基因mRNA水平;Westernblotting分別檢測(cè)CAST及外源ERCC1基因蛋白表達(dá)。
　　4、CAST基因沉默對(duì)內(nèi)外源性ERCC1表達(dá)的影響
　　采用Real-timePCR及Westernblotting分別檢測(cè)CAST基因沉默對(duì)內(nèi)外源ERCC1mRNA水平及蛋白表達(dá)。
　　5、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力的檢測(cè)
　　5.1細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn)(MTT)測(cè)定順鉑處理后細(xì)胞存活率;
　　5.2彗星實(shí)驗(yàn)

11、測(cè)定順鉑所致DNA的損傷情況;
　　結(jié)果
　　1、肺癌組織中CAST及ERCC1mRNA表達(dá)和順鉑耐藥性檢測(cè)
　　15例肺癌術(shù)中組織經(jīng)Real-timePCR分析表明CAST與ERCC1表達(dá)呈正相關(guān);原代細(xì)胞給予順鉑處理后，CAST與ERCC1基因分別與原代肺癌細(xì)胞的敏感性呈負(fù)相關(guān)，即表達(dá)量增加伴隨順鉑敏感性下降。
　　2、體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型構(gòu)建成功
　　2.1CAST-shRNA及ERCC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和

12、GFP質(zhì)粒分別同時(shí)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coliDH5α)，可選擇分別生長(zhǎng)于含氨芐和卡那霉素的LB瓊脂平板。對(duì)提純的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，CAST及ERCC1序列正確無(wú)誤。
　　2.2CAST-shRNA及ERCC1-overexpression質(zhì)粒及GFP空質(zhì)粒分別同時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。各轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在24h后熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)染成功及轉(zhuǎn)染效率。
　　2.3Real-timePCR篩選高沉默效率的

13、CAST-shRNA，RNAi3為最佳質(zhì)粒。
　　2.4Westernblotting分別檢測(cè)CAST及內(nèi)外源ERCC1基因蛋白表達(dá)，CAST及內(nèi)源ERCC1分別可表達(dá)蛋白分子量為34KD和33KD，外源ERCC1表達(dá)蛋白分子量為58KD，證實(shí)瞬時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。
　　3、CAST基因沉默對(duì)內(nèi)外源性ERCC1表達(dá)的影響
　　盡管過(guò)表達(dá)ERCC1，在CAST基因沉默的基礎(chǔ)上，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其內(nèi)外源ERCC1的mRNA水平

14、和蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力的檢測(cè)
　　4.1MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在CAST沉默的基礎(chǔ)上，隨著順鉑染毒濃度的增加，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞活性均呈下降趨勢(shì)，并存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，表明各濃度順鉑對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞活性均有抑制作用，且與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而在CAST-shRNA與ERCC1-overexpression共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，在

15、順鉑處理24h后，各濃度的細(xì)胞存活率并無(wú)明顯的差異，但是經(jīng)過(guò)24h的恢復(fù)，8μg/ml和128μg/ml兩個(gè)濃度的細(xì)胞活性均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.2彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CAST-shRNA與ERCC1-overexpression共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，在順鉑處理24h和處理24h后繼續(xù)培養(yǎng)24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，除8μg/ml順鉑處理24h后繼續(xù)培養(yǎng)24h外，其他各濃度相比較，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

16、隨著順鉑濃度的增大，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性，其產(chǎn)生的DNA鏈間交聯(lián)越嚴(yán)重。
　　結(jié)論
　　1.位于DNA修復(fù)基因ERCC13'UTR的重疊基因CAST與ERCC1表達(dá)呈正相關(guān);與順鉑所致肺癌細(xì)胞的敏感性呈負(fù)相關(guān)，即肺癌細(xì)胞CAST表達(dá)量增加伴隨順鉑敏感性下降。
　　2.本研究發(fā)現(xiàn)CAST沉默后，ERCC1表達(dá)受到抑制，同時(shí)對(duì)順鉑所致的DNA損傷修復(fù)能力下降，CAST成為ERCC1基因表達(dá)及其發(fā)揮功能重要的共同因