MsrB1(SelR)對過氧亞硝酸根誘發(fā)人晶狀體上皮細胞損傷的保護作用.pdf

1、白內(nèi)障特別是老年性白內(nèi)障是人類致盲的主要眼疾,嚴重影響人的生活質量。據(jù)推測,如能使白內(nèi)障的發(fā)生推遲10年,白內(nèi)障的手術會下降45％。因此,開展白內(nèi)障發(fā)病機理和預防研究是一個十分重要的課題。
　　白內(nèi)障的致病因子很多,病理復雜,但都與氧化應激導致晶狀體的損傷相關。過氧亞硝酸根(ONOO)作為一個強的生物氧化劑和硝化劑,與各種生物大分子反應,引起脂質過氧化、DNA損傷和蛋白質氧化硝化,可能是白內(nèi)障發(fā)病機制的一個重要方面。一些證據(jù)表明必

2、需微量元素硒對眼起重要的保健作用,其中,硒蛋白R(SelR)也稱蛋氨酸亞砜還原酶(Msr)B1在維持眼晶狀體透明中的作用,受到人們的關注。然而,MsrB1對ONOO誘發(fā)晶狀體上皮細胞損傷的保護作用,特別是其對晶狀體細胞分化中信號通路分子損傷的保護作用鮮見報道。
　　本論文以人晶狀體上皮(hLE)細胞SRA01/04為研究對象,探討了MsrB1對hLE細胞的保護作用及其可能的機理,主要結果如下:
　　(1)MsrB1對ONOO

3、誘導hLE細胞凋亡的抑制作用。
　　采用實時熒光定量PCR、MTT法、蛋白質印跡、熒光顯微鏡、透射電鏡、流式細胞術等方法研究了MsrB1對ONOO誘導的hLE細胞凋亡以及氧化還原平衡的調節(jié)。結果表明低濃度的ONOO可以刺激hLE細胞增殖,而高濃度的ONOO明顯導致hLE細胞死亡的增加。單獨的ONOO處理或MsrB1基因沉默都可以誘導hLE細胞中氧化應激和內(nèi)質網(wǎng)應激的發(fā)生,激活caspase-3,從而導致細胞凋亡。當MsrB1基因沉

4、默細胞經(jīng)300μMONOO處理后,使氧化應激水平、DNA斷裂水平、內(nèi)質網(wǎng)應激程度以及caspase-3活性進一步增加,從而加劇了hLE細胞的凋亡和死亡。以上研究結果表明,MsrB1在抑制ONOO導致的氧化應激,調節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原平衡和緩解內(nèi)質網(wǎng)應激中起著重要的作用,且MsrB1也可以通過抑制caspase-3的激活和DNA的氧化損傷保護hLE細胞抵抗由ONOO誘導的細胞凋亡的發(fā)生。我們的結果提示MsrB1正常活性的丟失可能有助于白內(nèi)障

5、的發(fā)生。
　　(2)MsrB1對ONOO誘導hLE細胞F-actin損傷的保護作用。
　　F-actin是細胞骨架的重要組成部分,在基本的細胞分裂、遷移和分化等過程中起著至關重要的作用。采用蛋白質印跡、免疫沉淀、信號通路抑制劑處理以及免疫熒光等方法研究了MsrB1對ONOO誘導hLE細胞中F-actin損傷的保護作用。結果表明低濃度的ONOO?可以促進F-actin的組裝,而高濃度的ONOO會損害F-actin的組裝,與此同

6、時,伴隨著ERK1/2激活和ERK1/2抑制。高濃度的ONOO?作用于MsrB1基因沉默的細胞加劇了細胞中F-actin的去組裝和ERK的失活,進一步的研究顯示F-actin的去組裝伴隨著F-actin蛋白硝化水平的增加,bFGF是通過MEK依賴性途徑激活ERK1/2的磷酸化,而ONOO是通過MEK非依賴性途徑激活的ERK1/2磷酸化。以上結果表明MsrB1可能通過抑制ONOO對F-actin蛋白的硝化和ERK的失活,保護hLE細胞避免

7、ONOO誘導的F-actin的損傷,提示MsrB1活性的丟失可能會對晶狀體細胞的增殖和分化造成影響。
　　(3)MsrB1對BCS誘導的hLE細胞氧化應激的調節(jié)。
　　采用MTT法、Cu/Zn-SOD試劑盒、熒光分光光度計、熒光顯微鏡和蛋白質印跡等方法研究了MsrB1對銅離子螯合劑BCS誘導的hLE細胞凋亡和氧化應激的影響。結果表明1000μMBCS處理細胞后,Cu/Zn-SOD活性顯著下降,伴隨著hLE細胞內(nèi)活性氧的累積,

8、導致細胞凋亡和死亡的發(fā)生。單獨的MsrB1基因沉默會誘導hLE細胞ROS水平的顯著增加,從而激活細胞的保護機制,誘導Cu/Zn-SOD活性增加。而BCS作用于MsrB1基因沉默的細胞,則進一步增加胞內(nèi)ROS水平以及細胞凋亡和死亡。蛋白質印跡檢測結果表明,BCS作用于MsrB1基因沉默細胞,誘導的細胞凋亡增加與ERK磷酸化水平的下降有關,這可能與BCS導致SOD的活性下降,O2·得不到及時的清除,使得ONOO的生成增加有關,導致ERK的硝