炎癥、氧化應(yīng)激與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系及辛伐他汀抗炎、抗氧化作用的研究.pdf

1、背景：
　　動(dòng)脈粥樣硬化所致的心、腦血管疾病是目前危害人類健康的首要疾病，其發(fā)病機(jī)制過去主要存在脂質(zhì)浸潤、血栓形成和損傷反應(yīng)3種學(xué)說，1999年Ross提出動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病的理論逐漸取得人們的認(rèn)同。近年的研究證實(shí)，粘附分子、細(xì)胞因子、生長因子和金屬蛋白酶參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展的炎癥過程，幾乎所有動(dòng)脈粥樣硬化的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素都和炎癥過程密切相關(guān)。血管粘附蛋白－1是20世紀(jì)80年代新發(fā)現(xiàn)的粘附分子，研究證實(shí)其在慢性炎癥

2、中被誘導(dǎo)或上調(diào)。目前血管粘附蛋白－1在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用研究甚少。核轉(zhuǎn)錄因子-κB廣泛存在于真核生物中，是一個(gè)由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族。近年研究顯示，它與動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病密切相關(guān)。上述炎癥因子在激活后可促進(jìn)動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，其在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成中起重要作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在血管病變形成中發(fā)揮重要作用。外源性的ROS刺激可以使配位基誘導(dǎo)的受體快速激活釋放細(xì)胞內(nèi)的O2·-和H2O

3、2，而越來越多的研究證明內(nèi)源性的ROS可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞原癌基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。他汀類藥物是目前治療高膽固醇血癥的一線藥物，研究證明他汀除了降脂作用外還具有抗炎抗氧化等多種作用，這在許多基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中均得到了不同程度的認(rèn)識和肯定。但是他汀類對接受氧化應(yīng)激刺激后的動(dòng)脈炎癥反應(yīng)的影響尤其是血管粘附蛋白-1的表達(dá)未見報(bào)道。
　　目的：
　　1、探討人動(dòng)脈硬化血管中血管黏附蛋白-1、核因子-κB的表達(dá)水平，并分析兩者的

4、相互關(guān)系及與動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；
　　2、研究一定濃度過氧化氫對兔血管平滑肌的作用，探討氧化應(yīng)激與動(dòng)脈硬化的關(guān)系；
　　3、研究辛伐他汀對過氧化氫誘導(dǎo)的兔血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響和對血管中血管黏附蛋白-1、核因子-κB表達(dá)的影響，探討他汀的抗炎抗氧化作用。
　　材料和方法：
　　1、20例人主動(dòng)脈血管標(biāo)本根據(jù)HE染色結(jié)果分為動(dòng)脈硬化組（15例）和正常對照組（5例），應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測血管標(biāo)本中炎癥因

5、子血管粘附蛋白-1、核因子-κB的表達(dá)水平，分析血管粘附蛋白-1、核因子-κB在兩組表達(dá)中的差異，并探討其病理意義。數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)和Spearman等級相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2、兔動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細(xì)胞進(jìn)入靜止期，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，分別加入濃度為0、1、10、50、100、200μmol/LH2O2，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，以0μmol/L組為對照。上述各組分別于培養(yǎng)24

6、h、48h、72h后，采用CCK-8法檢測血管平滑肌細(xì)胞增殖情況；TBA法檢測培養(yǎng)基中丙二醛含量，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、兔動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細(xì)胞進(jìn)入靜止期，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，分為①對照組；②過氧化氫刺激組，加入100μmol/L過氧化氫；③低濃度他汀干預(yù)組，加入100μmol/L過氧化氫溶液和辛伐他汀溶液10μmol/L；④高濃度他汀干預(yù)組，加入10

7、0μmol/L過氧化氫溶液和辛伐他汀溶液50μmol/L，分別于24h、48h、72h采用CCK-8法檢測血管平滑肌細(xì)胞增殖情況；TBA法檢測培養(yǎng)基中MDA含量，劃痕法檢測細(xì)胞遷移，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)免疫組化法檢測血管粘附蛋白－1、核因子-κB的表達(dá)。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1、人主動(dòng)脈血管標(biāo)本中炎癥因子的表達(dá)血管粘附蛋白-1主要在動(dòng)脈斑塊中平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，尤以斑塊肩部最為明顯。核因子-κB主要在動(dòng)脈

8、硬化血管的內(nèi)皮細(xì)胞、炎細(xì)胞的細(xì)胞核上表達(dá)，平滑肌細(xì)胞也有表達(dá)，少數(shù)以未活化的形式位于細(xì)胞漿；血管粘附蛋白-1和核因子-κB均顯色為棕黃色，正常血管對照染色核顯藍(lán)色。在動(dòng)脈硬化血管中VAP-1陽性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)為(17.54±9.86)/HP，15例中有6例弱陽性表達(dá)，9例陽性表達(dá)。NF-κB陽性表達(dá)率為(28.31±8.62)/HP，其中6例陽性表達(dá)，9例強(qiáng)陽性表達(dá)。在5例正常血管中VAP-1僅血管外膜輕度著色，NF-κB有少量弱陽性表達(dá)

9、或呈未活化狀態(tài)，陽性表達(dá)率為（6.35±2.28)/HP。兩組中血管粘附蛋白-1、核因子-κB的表達(dá)均有顯著差異（P<0.05）；VAP-1和NF-κB的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r=0.558，P=0.004）。
　　2、H2O2對VSMC的影響①H2O2對VSMC增殖的影響：10～100μmol/L的H2O2作用不同時(shí)間后，隨H2O2濃度的增加，VSMC呈增殖趨勢，與對照相比，H2O2濃度≤100μmol/L作用24h時(shí)，各組吸光度值

10、無明顯差異（P>0.05），作用48h、72h后，各組吸光度值顯著上升（P<0.01）；H2O2濃度為200μmol/L時(shí)，各時(shí)段吸光度值顯著降低（P<0.01）；②H2O2促VSMC生成MDA：作用24h后，H2O2刺激組與對照組相比所測A值無顯著差異；作用48h、72h后，與對照組相比，H2O2刺激組測得的A值隨H2O2濃度的增加而增大，呈劑量依賴性；且作用72h所測A值大于48h（P<0.05）。
　　3、辛伐他汀的抗炎抗氧

11、化作用①抑制兔血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移：加入不同濃度的辛伐他汀作用24h后，他汀干預(yù)組與對照組相比無顯著差異（P>0.05）；作用48h后，兩種濃度辛伐他汀組可抑制經(jīng)過氧化氫誘導(dǎo)的兔血管平滑肌細(xì)胞增殖（P<0.01）；作用72h后，兩種濃度辛伐他汀組均顯著抑制兔血管平滑肌細(xì)胞增殖（P<0.01），且高濃度辛伐他汀組作用大于低濃度辛伐他汀組（P<0.05）；加入不同濃度的辛伐他汀作用72h后可顯著抑制由過氧化氫刺激引起的兔動(dòng)脈血管平滑肌

12、細(xì)胞遷移。②降低細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量：兩種濃度辛伐他汀作用48h和72h均顯著抑制兔血管平滑肌細(xì)胞中MDA的水平（P<0.01）。作用72h后比48h的抑制作用更大，且兩組辛伐他汀組間有顯著差異（P<0.05）；③抑制核因子-κB表達(dá)：正常對照組中核因子-κB表達(dá)較低；培養(yǎng)基中加入過氧化氫時(shí)，兔血管平滑肌細(xì)胞中核因子-κB表達(dá)顯著增加（P<0.01），辛伐他汀可抑制這一表達(dá)，且高濃度組較低濃度組抑制作用更顯著(P<0.05)。④對血管

13、黏附蛋白-1的作用：免疫組化結(jié)果顯示，血管黏附蛋白-1在四組中均輕度著色，無明顯陽性結(jié)果，四組相比未見差異。
　　結(jié)論：
　　1、血管黏附蛋白-1、核因子-κB在動(dòng)脈硬化斑塊中有大量表達(dá)，且血管粘附蛋白－1與核因子-κB的表達(dá)呈明顯正相關(guān)；
　　2、一定濃度的過氧化氫可誘導(dǎo)兔血管平滑肌細(xì)胞的增殖，且能使細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA水平升高；
　　3、一定濃度的辛伐他汀可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的兔血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移，并抑制核