TLR4參與腦缺血再灌注小鼠皮質和海馬細胞凋亡.pdf

1、腦血管疾病是目前嚴重威脅人類健康的疾病之一，其中缺血性疾病更占多數(shù)。腦缺血致腦細胞損傷，當恢復血液灌注后，其缺血性損傷反而進一步加重，我們稱其為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia—reperfusion injury)。其發(fā)病機制涉及能量代謝障礙，細胞酸中毒，細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，氧化應激損傷，興奮性氨基酸生成，炎癥損傷及細胞凋亡等。這些環(huán)節(jié)彼此重疊，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)。 凋亡，也稱程序性細胞死亡，凋亡機制在

2、缺血性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但其確切機制尚不清楚。腦缺血損傷后，凋亡程序的激活需要新基因的表達和某些“死亡蛋白”的合成。內(nèi)源性凋亡調(diào)節(jié)基因的表達可能在決定缺血神經(jīng)細胞的生死命運中起關鍵作用。caspase家族是一大類凋亡調(diào)節(jié)基因，其中caspase—3是caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中caspase—3不僅可促進腦發(fā)育時期神經(jīng)元的凋亡；還可促進各種因素

3、誘導的培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡，提示caspase—3可能是缺血神經(jīng)元凋亡重要效應分子。 Toll樣受體4(Toll like recep tors，TLR4)是與果蠅Toll蛋白同源的人Toll蛋白基因編碼的Toll樣受體蛋白，是新近發(fā)現(xiàn)的先天性免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體及病原模式識別受體之一，在急性炎癥反應細胞吞噬作用的調(diào)節(jié)和細胞信號轉導及細胞凋亡中起重要作用。它主要介導G—菌感染LPS的信號轉導，最終導致NF—κB的轉位與相應免疫基

4、因的活化而轉錄，釋放前炎癥因子及輔助刺激分子(Co—stimulate moleculars)，起到調(diào)節(jié)炎癥反應的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在腦缺血再灌注損傷中炎癥反應中起到了非常重要的作用，TLR4很可能參與了腦缺血再灌注損傷中細胞凋亡機制中的某個信號傳導通路，但它如何具體參與哪項機制尚需要進一步研究。 本文利用免疫組織化學、TUNEL法及Western blot方法，觀察在缺血再灌注后及缺血再灌注后阻斷TLR4，小鼠大腦皮

5、質和海馬兩個部位的Caspase—3表達量的變化和細胞凋亡情況，探討TLR4與小鼠腦缺血再關注損傷中細胞凋亡的關系。通過這些問題的解決，我們將進一步清楚腦缺血再灌注損傷發(fā)病的信號轉導機制，為尋找新的治療方法提供理論依據(jù)。 材料和方法: 一、實驗材料 1、實驗動物本研究采用中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供的健康昆明小鼠90只，體重20-30g。 2、主要試劑TLR4單克隆抗體(Santa Cruz公司)，Cas

6、pase—3兔抗鼠多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，二抗山羊抗兔多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，TUNEL檢測試劑盒(Roche公司)，免疫組化SP試劑盒和DAB試劑盒(邁新公司)。β—actin，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二次抗體，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔二次抗體均購于北京中山公司。 3、主要儀器電熱恒溫干燥箱；電子分析天平；恒溫水浴箱；低溫冷凍離心機；紫外分光光度計；通用電泳儀；轉印儀；正置熒光顯微鏡；

7、—80度深低溫冰箱；恒溫冰凍切片機；Motic Images Advanced3.2圖象分析系統(tǒng)；勻漿機；離心機：加樣器。 二、實驗方法 1、制備腦缺血再灌注損傷動物模型．采用夾閉雙側頸總動脈法。 2、動物處理和分組動物隨機分為3組，每組30只：假手術組(Sham)；缺血再灌注組(I/R)；TLR4抗體阻斷組(TLR4)。I/R組和TLR4組采用夾閉雙側頸總動脈造成短暫前腦缺血12 min，TLR4阻斷組在缺血后

8、從右側頸總動脈由微量注射器注入TLR4抗體(10mg/ml)。Sham組只暴露雙側頸總動脈12 min，之后再分為再灌注6h、12h、24h、48h、72h五個時間點。 3、HE染色觀察皮質、海馬組織病理學變化。 4、免疫組織化學檢測各組小鼠大腦皮質和海馬組織中Caspase—3的表達。 5、Western blot方法檢測各組小鼠大腦皮質和海馬組織中Caspase—3的表達。 6、TUNEL法原位檢測各

9、組小鼠大腦皮質和海馬組織中的細胞凋亡情況。 7、圖象分析 HE染色切片圖像分析，并進行神經(jīng)病理損傷評分。Western blot結果用ChemiImager5500V2.03軟件掃描，用Fluor Chen2.0軟件定量分析顯色帶的IDV值。免疫組化結果用Motic Images Advanced3.2實時圖象分析系統(tǒng)采集照片并進行定量分析。TUNEL法原位檢測細胞凋亡結果在高倍顯微鏡下測定海馬區(qū)5視野凋亡細胞的平均凋亡

10、率。 8、統(tǒng)計學處理 所有數(shù)值均以均數(shù)±標準差表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較進行單因素方差分析。 實驗結果: 1、組織病理學觀察結果及神經(jīng)病理損傷評分結果 HE染色可見假手術組皮質和海馬細胞形態(tài)正常，細胞排列整齊、形態(tài)完整；缺血再灌注組細胞排列散亂，有的胞漿空泡形成，有的神經(jīng)元腫脹、分布不均、核固縮深染、核仁消失；TLR4阻斷組神經(jīng)元胞體腫脹明顯減輕，細胞形態(tài)明顯改

11、善。 假手術組皮質和海馬神經(jīng)元在各再灌注時間點神經(jīng)病理損傷評分均較低；TLR4阻斷組和缺血再灌注組的神經(jīng)病理損傷評分均有不同程度的增高，兩組與假手術組比較差異有顯著性(P<0.05)。TLR4阻斷組在各再灌注時間點神經(jīng)病理損傷評分均低于缺血再灌注組(P<0.05)。 2、Caspase—3在皮質的表達和TUNEL皮質細胞凋亡檢測結果 免疫組織化學結果顯示：在相同時間點，缺血再灌注組大腦皮質部Caspase—3陽性

12、產(chǎn)物的平均光密度值(MOD)顯著高于假手術組(P<0.05)；而TLR4阻斷組與缺血再灌注組相比，大腦皮質部Caspase—3陽性反應產(chǎn)物的平均光密度值明顯降低(P<0.05)。 Western blot結果顯示：在相同時間點，與假手術組比較，缺血再灌注組小鼠大腦皮質部Caspase—3目標帶的IDV(integrated density value)與內(nèi)參照IDV的比值均明顯升高(P<0.05)，而TLR4阻斷組上述部位樣品中

13、Caspase—3目標帶的IDV與內(nèi)參照IDV的比值均明顯低于缺血再灌注組(P<0.05)。 TUNEL細胞凋亡檢測結果顯示：在相同時間點，缺血再灌注組大腦皮質部凋亡細胞較假手術組高，TLR4阻斷組大腦皮質部凋亡細胞較缺血再灌注組減少(p<0.05)。 3、Caspase—3在海馬的表達和TUNEL細胞凋亡檢測結果 免疫組織化學結果顯示：在相同時間點，缺血再灌注組大腦海馬部Caspase—3陽性產(chǎn)物的平均光密度值

14、(MOD)顯著高于假手術組(P<0.05)；而TLR4阻斷組與缺血再灌注組相比，大腦海馬部Caspase—3陽性反應產(chǎn)物的平均光密度值明顯降低(P<0.05)。 Western blot結果顯示：在相同時間點，與假手術組比較，缺血再灌注組小鼠大腦海馬部Caspase—3目標帶的IDV(integrated density value)與內(nèi)參照IDV的比值均明顯升高(P<0.05)，而TLR4阻斷組上述部位樣品中Caspase—3

15、目標帶的IDV與內(nèi)參照IDV的比值均明顯低于缺血再灌注組(P＜0.05)。 TUNEL細胞凋亡檢測結果顯示：在相同時間點，缺血再灌注組大腦海馬部凋亡細胞較假手術組高，TLR4阻斷組大腦海馬部凋亡細胞較缺血再灌注組減少(p<0.05)。 結論: 缺血再灌注組小鼠大腦皮質和海馬部位Caspase—3表達量和神經(jīng)細胞凋亡明顯增多，TLR4阻斷后，明顯減少，提示TLR4參與了小鼠腦缺血再灌注損傷中大腦皮質和海馬區(qū)的神經(jīng)細