糞菌移植治療小鼠艱難梭菌感染的安全性評價.pdf

1、目的：
　　艱難梭菌（Clostridium difficile，CD）是一種革蘭染色陽性、專性厭氧的粗大芽孢桿菌，在生存環(huán)境惡劣的情況下可形成次級端芽孢，主要在人與人之間通過糞口途徑傳播并定植于腸道。正常成人艱難梭菌無癥狀攜帶率為5-15％，住院患者可達57％，嬰幼兒艱難梭菌攜帶率比成人高，可達84.4％。艱難梭菌是院內獲得性腹瀉的主要病原菌，也是社區(qū)獲得性腹瀉的重要致病菌。
　　1978年，第一次發(fā)現(xiàn)了艱難梭菌與偽膜性腸

2、炎(Pseudomembranous colitis，PMC)相關。正常情況下，艱難梭菌可存在于腸道中，并不致病。當長期大量應用廣譜抗生素等原因造成腸道穩(wěn)態(tài)失衡，艱難梭菌過度繁殖，引起艱難梭菌相關性感染（Closrtidium difficile infection，CDI）的發(fā)生，可導致艱難梭菌感染相關性腹瀉（Clostridium difficile associated diarrhea，CDAD）。CDI是15％～25％抗生素相

3、關性腹瀉(Antibiotic-associated diarrhea，AAD)的病因，也是幾乎所有抗生素相關性偽膜性結腸炎的病因。
　　臨床上大多數(shù)患者感染艱難梭菌后無癥狀，表現(xiàn)為健康攜帶者;出現(xiàn)臨床癥狀者可表現(xiàn)為輕至重度水樣瀉、暴發(fā)性腸炎、偽膜性腸炎甚至感染性休克等全身癥狀。腹瀉癥狀常出現(xiàn)于應用抗生素的過程中或是停用抗生素短期內，偶有停用數(shù)月后發(fā)病者。所有抗生素都可引起艱難梭菌感染，其中克林霉素、頭孢菌素類和喹諾酮類引起的感染

4、風險更高，而哌拉西林/他唑巴坦、替加環(huán)素等則很少引發(fā)CDI。目前CDI的標準治療方案是使用甲硝唑或萬古霉素，但高達25％的患者在使用這2種抗生素后30天內可出現(xiàn)復發(fā)，初次復發(fā)后再次復發(fā)率則可升高至40-65％。復發(fā)性CDI不僅難以治療，而且會影響患者數(shù)月甚至數(shù)年，降低其生活質量，增加經濟負擔。
　　由于廣譜抗生素的濫用、高毒力菌株的出現(xiàn)、菌株耐藥率增加等因素，CDI的發(fā)病率逐年升高，特別是在近期有住院史或是長期居住在照護機構的老年

5、人群中。歐美國家曾多次發(fā)生爆發(fā)流行，流行期間病死率明顯升高，導致醫(yī)療保健費用隨之增加。為了更好地進行艱難梭菌感染發(fā)病機制的研究、疫苗的制備、新治療方案的評價等，須建立穩(wěn)定可靠的CDAD動物模型。
　　倉鼠、豚鼠、無菌鼠、大鼠和小鼠都曾作為CDAD的模型動物。過去應用最廣的是倉鼠模型，但由于倉鼠感染艱難梭菌后腹瀉癥狀重，是一種暴發(fā)性、致死性的疾病過程。這與國內臨床上人體感染艱難梭菌的常見結局不同，無法完全代表人類的感染過程。由于發(fā)現(xiàn)

6、誘導小鼠易感性增加的新方法以及可應用于小鼠宿主組織分析的特異性試劑的改進等原因，近幾年小鼠CDI模型的應用增加。Chen等發(fā)現(xiàn)經過混合抗生素+克林霉素誘導后，C57BL/6小鼠可成功感染艱難梭菌并出現(xiàn)腹瀉，感染過程與人類相似，從而成為目前CDAD主要的模型動物。但我們前期研究發(fā)現(xiàn)應用本課題組臨床分離菌株進行建模，C57BL/6模型鼠感染嚴重程度難控制，多數(shù)小鼠腹瀉程度較輕，呈自愈性，可能限制其在難治性及復發(fā)性艱難梭菌感染研究中的應用。故

7、本研究選擇國內科研常用的3種品系小鼠，擬構建不同品系小鼠CDAD動物模型，并通過臨床和病理指標對動物模型進行評估，篩選出最具臨床代表性且穩(wěn)定的動物模型，為艱難梭菌感染相關研究提供可靠的實驗工具。
　　糞菌移植(Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是指將健康人糞便中的功能菌群，移植到患者胃腸道內，重建具有正常功能的腸道菌群，從而達到治療腸道及腸道外疾病的目的。近十年來，因為在治療艱難梭菌感染方面

8、療效突出，糞菌移植受到國內外越來越多的關注。目前全世界已報道數(shù)千例應用糞菌移植的病例，這些病例中包括胃腸道疾?。ㄈ缙D難梭菌感染、炎癥性腸病、腸易激綜合征等）和非胃腸道疾?。ㄈ缙诰C合征、特發(fā)性血小板減少性紫癜等）。
　　糞菌移植治療難治性艱難梭菌感染有效率可達80％-90％，并且相較于應用萬古霉素等治療方案，F(xiàn)MT療程短、花費少、效果明顯。2013年2月，美國食品及藥品監(jiān)督管理局將FMT寫入CDI治療指南中:建議在間歇性萬古霉素治

9、療后第三次復發(fā)時，即可考慮使用FMT。
　　雖然目前FMT已經用于多種疾病的臨床治療，但是FMT作為一項尚不完全成熟的臨床治療手段，其長期安全性問題，還缺乏足夠的臨床和實驗室資料。最主要的不良反應包括噯氣、腹脹、腹部絞痛等消化道癥狀;而部分患者在FMT后可出現(xiàn)低熱、腹瀉增加等小腸細菌過度生長的癥狀，該癥狀多在FMT后3天內消失。此外，F(xiàn)MT更大的風險可能是基于腸道菌群的改變，誘發(fā)慢性病的發(fā)生。目前已知腸道菌群與一些疾病的發(fā)生相關，

10、包括肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化、炎癥性腸病、結腸癌、非酒精性脂肪肝、腸易激綜合征、哮喘和自閉癥等。改變宿主原有的腸道菌群結構，可能增加發(fā)生這些疾病的風險。
　　目前還沒有足夠研究來證實FMT的安全性，本研究擬通過小鼠CDAD模型驗證FMT治療艱難梭菌感染的有效性，同時初步探索FMT對宿主行為活動、代謝、免疫等方面的影響，為評價FMT的安全性提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.構建艱難梭菌感染小鼠穩(wěn)定模型，挑選理想的模型動物

11、
　　選擇南方醫(yī)院臨床分離菌株共50株進行復蘇培養(yǎng)，通過觀察菌落形態(tài)、鏡下形態(tài)、乳酸脫氫酶檢測、生化鑒定及毒素檢測等方法鑒定。根據(jù)核糖分型，選擇其中最為常見的作為本研究實驗菌株。
　　選擇C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠，3種品系小鼠各24只，按隨機分組原則分為4組（對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組），每組6只。實驗組經抗生素誘導后，分別予以不同濃度(108CFU/ml～1010CFU/ml)的臨床分離菌株混懸液灌

12、胃，觀察不同品系小鼠不同時間點腹瀉、全身情況及結腸組織病理學變化。
　　2.BALB/c小鼠腹瀉癥狀呈細菌濃度依賴性
　　低濃度組(108CFU/mL)中C57BL/6小鼠(n=6)未出現(xiàn)腹瀉;BALB/c小鼠3只出現(xiàn)重度腹瀉癥狀;KM小鼠1只出現(xiàn)輕度腹瀉癥狀。
　　中濃度組(109CFU/mL)中C57BL/6小鼠1只輕度腹瀉;BALB/c小鼠5只出現(xiàn)重度腹瀉癥狀，濕尾范圍較其低濃度組稍大;KM小鼠4只出現(xiàn)不同程度腹

13、瀉，其中1只死亡，至觀察終點存活率為83.3％。
　　高濃度組(1010CFU/mL)中C57BL/6小鼠3只出現(xiàn)重度腹瀉;BALB/c小鼠6只均出現(xiàn)腹瀉，1只小鼠死亡，至觀察終點存活率為83.3％; KM小鼠4只出現(xiàn)腹瀉癥狀，未發(fā)現(xiàn)死亡。
　　感染后小鼠平均體重下降明顯，同時觀察到小鼠活動度下降，毛發(fā)脫落，嚴重者出現(xiàn)弓背。
　　3.腹瀉小鼠糞便中分離出艱難梭菌
　　隨機選取3種腹瀉小鼠糞便涂片、染色，可見不同程

14、度腸道菌群失調及革蘭陽性粗大芽孢桿菌。將腹瀉小鼠糞便或腸內容物接種至CCFA-HT培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)并分純，可見艱難梭菌典型菌落形態(tài)。核型分析證實小鼠糞便分離菌株核型與實驗菌株一致。
　　4.結腸病理評分與癥狀嚴重程度相關
　　健康對照組0分，低濃度組中C57BL/6小鼠為0.3±0.5、BABL/c小鼠為1.5±0.5、KM小鼠為0.7±0.5，中濃度組中C57BL/6小鼠為0.7±0.5、 BABL/c小鼠為2.0±0.9、

15、KM小鼠為1.8±1.7，高濃度組中C57BL/6小鼠為1.0±0.6、BABL/c小鼠為3.2±1.2、KM小鼠為1.8±1.0。
　　5.糞菌移植治療小鼠艱難梭菌感染
　　BALB/c小鼠共60只，按隨機分組原則分為4組，每組15只。根據(jù)不同處理分為空白對照組、灌菌組、單次FMT組、3次FMT組，在3個時間點（FMT后1天、FMT后1周、FMT后1月）每組分別處死5只。建模前及每次處死前進行曠場實驗。
　　結果：<

16、br>　　1.FMT治療組腹瀉小鼠減少，未出現(xiàn)死亡.
　　2.FMT能減輕小鼠腸道炎癥.
　　結論:
　　1.以BALB/c小鼠為對象，予慶大霉素、甲硝唑、多粘菌素、萬古霉素、卡那霉素混合抗生素溶液連續(xù)灌胃9天+克林霉素腹腔注射做預處理，24h后予1010CFU/ml細菌混懸液灌胃即可成功建立穩(wěn)定的具有臨床代表性的小鼠CDAD模型;
　　2.治療小鼠艱難梭菌感染時，增加糞菌移植次數(shù)未能明顯增加療效;
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