重組人白血病抑制因子、柔紅霉素對(duì)DAMI細(xì)胞株的作用研究.pdf

1、白血病(Leukemia)是人體造血組織的惡性疾病,也是兒章期發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤疾病,是五歲以下兒童死亡的主要原因之一,白血病的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡(Cell apoptosis)異常有密切關(guān)系,凋亡是一種基因(Gene)指導(dǎo)下的細(xì)胞主動(dòng)自我消亡過(guò)程,它是正常胚胎發(fā)生過(guò)程和成人組織器官發(fā)育中細(xì)胞清除的正常途徑,當(dāng)?shù)蛲鐾肥艿揭种苹蜃钄嗑涂梢允辜?xì)胞永生化而惡變.凋亡涉及到一系列的基因調(diào)控(Gene regulation),促進(jìn)凋亡的

2、基因有Bax、p53家族等.凋亡理論的提出不僅為白血病病因和發(fā)病機(jī)制開(kāi)辟了新的領(lǐng)域,而且為白血病的治療提供了新的思路. 現(xiàn)知許多治療白血病的傳統(tǒng)化療藥物如柔紅霉素(Daunorubicin)、甲氨蝶呤(Metlaotrexate)等都能夠通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡而起到治療白血病的作用,化療幾乎是治療白血病的唯一選擇.以兒童急性淋巴細(xì)胞白血病為例,二十世紀(jì)40年代后期主要局限于尋找有效的單一化療藥物,緩解和生存率很低,二十世紀(jì)50年代及

3、60年代初發(fā)展了聯(lián)合化療和維持治療.五年無(wú)病生存率達(dá)10﹪～20﹪,此后由于治療白血病新藥的問(wèn)世,五年無(wú)病生存率已經(jīng)達(dá)到50﹪～80﹪,近年許多細(xì)胞因子的出現(xiàn)為白血病的治療提供了新的策略. 為探索某些細(xì)胞因子和化療藥物對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,本研究以急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(acute myeloid leukemia,AML)株DAMI細(xì)胞為靶細(xì)胞通過(guò)CCK-8法、流式細(xì)胞儀及免疫組化法對(duì)細(xì)胞增殖、早期凋亡指標(biāo)、細(xì)胞周期及P73基

4、因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),探討單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用重組人白血病抑制因子(recombinanthuman leukemia inhibitory,rh-LIF)和柔紅霉素對(duì)DAMI細(xì)胞的增殖與凋亡的影響,闡明有關(guān)機(jī)制,為白血病的臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù). 方法:將DAMI細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10﹪小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,37℃,5﹪CO<,2>培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng),每2～3天傳代一次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).應(yīng)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察不

5、同濃度的rh-LIF,DNR及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)DAMI細(xì)胞作用6h、12h、24h、48h后細(xì)胞株增殖及活力的變化,用流式細(xì)胞儀測(cè)早期凋亡指標(biāo)Annexin V,免疫組化法檢測(cè)用藥前后P73蛋白的表達(dá)變化、通過(guò)細(xì)胞周期測(cè)定來(lái)分析細(xì)胞發(fā)生凋亡的周期.全部數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示.方差齊時(shí)用兩組間的均數(shù)比較用t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)兩組間的均數(shù)比較用秩和檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05. 結(jié)果:1不

6、同濃度的rh-LIF(1,5,10,20,40 ng/m1)對(duì)DAMI細(xì)胞株作用于6h、12h、24h、48h后,觀察細(xì)胞株的增殖變化,當(dāng)rh-LIF濃度較低時(shí)(1ng/ml)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯(P>0.05),而當(dāng)rh-LIF濃度增高(≥5ng/ml)時(shí),對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng),差異有顯著性意義(P>0.05),流式細(xì)胞儀測(cè)定早期凋亡指標(biāo)發(fā)現(xiàn)濃度為1ng/ml時(shí)凋亡不明顯(P>0.05),≥5ng/ml時(shí)凋亡率增高(P<0.

7、05),隨著rh-LIF濃度的逐漸增高p73蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率也明顯增高,差異有顯著性意義(P<0.05),p73蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與藥物濃度和作用時(shí)間呈一定的相關(guān).細(xì)胞周期分析顯示多數(shù)細(xì)胞被阻滯于G<,0>/G<,1>期. 2 不同濃度的DNR(0.5,1,2,4,8μmol/L),對(duì)DAMI細(xì)胞株作用于6h、12h、24h、48h后觀察細(xì)胞株的增殖變化,濃度0.5μmol/L時(shí)抑制作用不明顯(P>0.05),1,2,4,8μmo

8、l/L時(shí),隨著濃度加大、時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用越越明顯,差異有顯著性意義(P<0.05). 0.5 μ mol/L時(shí)細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生凋亡,在0.5,1,2μmol/L時(shí)細(xì)胞隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率顯著增高(P<0.05),4,8 μ mol/L時(shí)凋亡率則有下降趨勢(shì).0.5,1,2μmol/L時(shí)免疫組化顯示p73蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率增高. 4,8μ mol/L時(shí)p73蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率降低.細(xì)胞周期分析顯示DNR作用于DAMI細(xì)胞后被阻滯于G<,0>/

9、G<,1>期. 3 rh-LIF與DNR聯(lián)合作用于DAMI細(xì)胞株對(duì)細(xì)胞增殖的抑制、細(xì)胞凋亡率的變化所示比單用rh-LIF的作用強(qiáng)(P<0.05),與單用DNR相比無(wú)明顯差別、p73蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與單用rh-LIF或DNR相比陽(yáng)性表達(dá)率低(p<0.05),細(xì)胞周期分析顯示rh-LIF與DNR聯(lián)合作用于DAMl細(xì)胞后被阻滯于G0/G1期. 結(jié)論:1.rh-LIF和柔紅霉素可抑制DAMI細(xì)胞株的生長(zhǎng),呈濃度、時(shí)間依賴性;p73