基于小鼠白血病細(xì)胞株的HIV-1感染細(xì)胞模型研究.pdf

1、目的：
　　基于鼠白血病細(xì)胞（L615和L1210），建立一種能夠表達(dá)hCD4/CCR5/cyclinT1的跨物種感染HIV-1的細(xì)胞模型。人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）是一種感染人體免疫系統(tǒng)細(xì)胞，破壞和損傷其功能，最終導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）即艾滋病發(fā)生的病原體。艾滋病自1981年第一次報(bào)道以來

2、，作為一種公共衛(wèi)生和社會問題，就一直危害著人類的生存和發(fā)展。HIV具有很強(qiáng)的物種特異性，這導(dǎo)致，在非人靈長類動(dòng)物中采用嵌合的猴-人免疫缺陷病毒（simian-human immunodeficiency virus,SHIV）進(jìn)行細(xì)胞與動(dòng)物模型的制備；在鼠類中，僅能通過選擇重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠（severe combined immunodeficiency,SCID），移植人類組織細(xì)胞實(shí)現(xiàn)HIV-1的感染而進(jìn)行動(dòng)物模型的制備。為實(shí)現(xiàn)HI

3、V-1跨種族于鼠細(xì)胞的HIV-1入胞感染以及病毒的完整復(fù)制的細(xì)胞模型，而設(shè)置本課題研究。
　　方法：
　　首先，應(yīng)用Gateway技術(shù)，構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒pLV[Exp]-EGFP/Neo-CMV>hCD4:T2A:hCCNT1:IRES:hCCR5，經(jīng)核苷酸測序分析確認(rèn)目的基因無誤后進(jìn)行慢病毒表達(dá)載體包裝；將制備的慢病毒載體感染293T細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測293T細(xì)胞中hCD4、hCCR5和hCyclinT1基因在mR

4、NA水平的表達(dá)情況，以明確制備的慢病毒載體hCD4/CCR5/CyclinT1基因表達(dá)情況。然后，將加載hCD4/CCR5/cyclinT1的慢病毒載體以最佳感染復(fù)數(shù)感染L615及 L1210細(xì)胞，提取L615及L1210的RNA和蛋白質(zhì)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）、免疫印跡法（Western blot）、免疫熒光法檢測L615及L1210細(xì)胞中hCD4、hCCR5和hCyclinT1的表達(dá)率。最后，對轉(zhuǎn)基因的L615及 L12

5、10進(jìn)行HIV-1感染，通過RT-PCR檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液及胞體中的HIV-1RNA，驗(yàn)證hCD4/CCR5/cyclinT1轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞對HIV-1感染的敏感性。
　　結(jié)果:
　　核苷酸測序結(jié)果表明hCD4、hCCR5和hCyclinT1均已正確地插入到質(zhì)粒載體中；通過熒光顯微鏡可以直接觀察到由EGFP標(biāo)記的慢病毒載體；qRT-PCR結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空載慢病毒相比，基于表達(dá)hCD4/CCR5/cyclinT1分子的慢

6、病毒載體的hCD4、hCCR5和hCyclinT1基因在mRNA水平的表達(dá)量相當(dāng)高，這表明基于表達(dá)hCD4/CCR5/cyclinT1分子的慢病毒載體是成功構(gòu)建的。L615及L1210細(xì)胞經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR結(jié)果說明這兩種細(xì)胞可以陽性表達(dá)hCD4、hCCR5和hCyclinT1 mRNA；Western blot檢測結(jié)果顯示L615及L1210細(xì)胞中 hCD4、hCCR5和hCyclinT1蛋白的表達(dá)；免疫熒光的結(jié)果表明h

7、CD4、hCCR5和hCyclinT1是可以在L615及L1210細(xì)胞膜上表達(dá)的。以上研究結(jié)果證實(shí)，慢病毒載體可將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，通過慢病毒載體介導(dǎo)hCD4/CCR5/cyclinT1進(jìn)入L615和L1210細(xì)胞是可行的。轉(zhuǎn)基因的L615及L1210感染HIV-1后，RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞系的培養(yǎng)上清液及胞體中都檢測到HIV-1RNA，說明在感染表達(dá)hCD4/CCR5/cyclinT1的慢病毒后，L615及L1210可以支持H