RNA干擾沉默肺泡巨噬細(xì)胞MD-2對(duì)脂多糖所致大鼠急性肺損傷的影響.pdf

1、背景和目的：急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)以及效應(yīng)細(xì)胞共同參與的、過度失控的炎癥反應(yīng)是發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于炎癥反應(yīng)的環(huán)節(jié)眾多、過程復(fù)雜，難以選擇有效的靶點(diǎn)，故缺乏有效的抗炎治療方法，ALI的病死率仍相當(dāng)高。致病因子參與的炎癥反應(yīng)的上游環(huán)節(jié)則簡單得多，可能會(huì)成為防治過度炎癥反應(yīng)的靶點(diǎn)。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性桿菌的主要致病成分，是導(dǎo)致

2、ALI的重要致病因素。LPS由Toll樣受體4(Toll like receptor4，TLR4)及髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiationprotein2，MD-2)組成的復(fù)合受體介導(dǎo)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并通過激活效應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的一系列下游信號(hào)分子，引起細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的大量釋放。MD-2在識(shí)別LPS和輔助TLR4將LPS信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的過程中起到核心作用。本研究探討MD-2在LPS所致大鼠.ALl中的作用，以及RNA

3、干擾沉默肺泡巨噬細(xì)胞MD-2基因?qū)PS/TLR4-MD-2/MyD88信號(hào)通路及細(xì)胞因子分泌的影響。
　　方法：1)采用尾靜脈注射LPS方法誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，20只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和LPS組，測(cè)定肺組織濕/干重比值(W/D)，肺組織標(biāo)本石蠟切片常規(guī)HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變，通過支氣管肺泡灌洗獲取肺泡巨噬細(xì)胞，采用半定量RT-PCR、Western Blot以及免疫組化等方法分別檢測(cè)肺組織標(biāo)本和肺泡巨噬細(xì)胞MD-2 mR

4、NA及蛋白的表達(dá)情況，采用ELISA方法測(cè)定血清TNF-α水平。
　　2)體外培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383，用以下兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：用不同濃度(0.01μg/ml～10μg/ml)的LPS刺激細(xì)胞2h；用單一濃度(1μg/ml)的LPS刺激細(xì)胞2h～24h。采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞TLR4 mRNA和MD-2mRNA的表達(dá)，采用ELISA方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。3)設(shè)計(jì)合成5對(duì)

5、針對(duì)MD-2的小干擾RNA片段(MD-2 siRNA)，運(yùn)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將MD-2 siRNA轉(zhuǎn)染至NR8383細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)細(xì)胞MD-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，篩選出最佳MD-2 siRNA序列進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。采用以下兩種方法對(duì)NR8383細(xì)胞進(jìn)行LPS刺激：細(xì)胞先經(jīng)LPS刺激2h，然后轉(zhuǎn)染MD-2 siRNA，稱之為LPS+1組：用MD-2 siRNA沉

6、默細(xì)胞MD-2基因，然后給予LPS刺激2h，稱之為LPS+2組。設(shè)置未轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞作為對(duì)照組(Blank)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)細(xì)胞MD-2 mRNA、TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表達(dá)，采用WesternBlot方法檢測(cè)細(xì)胞MD-2蛋白的表達(dá)，采用ELISA方法分別測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。
　　結(jié)果：1)與對(duì)照組比較，LPS組大鼠的肺組織W/D增大，肺泡巨噬細(xì)

7、胞和肺組織標(biāo)本中MD-2 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)，血清TNF-α水平也明顯升高(P<0.01)。2)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383表達(dá)MD-2 mRNA和TLR4mRNA，其中對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.05和0.44±0.09；在0.01μg/mlLPS的刺激下，兩者表達(dá)無明顯變化；在0.1μg/ml時(shí)表達(dá)量增加：隨著LPS濃度的升高表達(dá)量進(jìn)一步增加；在10μg/ml刺激下兩者的相對(duì)表達(dá)量分別為0.72

8、±0.06和0.65±0.10(P<0.01)。TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度具有類似變化。在1μg/ml LPS刺激下，TLR4和MD-2 mRNA的表達(dá)量在2 h明顯增加，至6 h達(dá)高峰(0.67±0.05和0.59±0.05)，8 h開始回落，但24 h仍高于基礎(chǔ)值(P<0.01)。TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度具有類似變化，其中TNF-α和IL-1β在6 h達(dá)高峰，持續(xù)至8 h，IL-6在8 h達(dá)高峰，持續(xù)至12

9、 h。TLR4 mRNA和MD-2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.513，P<0.01)。3)通過檢測(cè)MD-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，篩選出最佳MD-2 siRNA序列(正義鏈：5’-CCA UAU UUA CUG AAU CUG ATT-3’；反義鏈：5’-UCA GAU UCA GUA AAU AUG GGA-3’)，在mRNA水平的最佳干擾時(shí)間為24 h，基因沉默效率為67％。對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后MD-2、TLR4和MyD88

10、 mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)，MD-2蛋白合成顯著增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高(P<0.01)。在LPS+1實(shí)驗(yàn)中，干擾組細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后MD-2 mRNA的表達(dá)量與LPS未刺激組比較未見明顯上調(diào)(P>0.05)；而TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)(0.69±0.10和0.82±0.09 vs0.44±0.12和0.62±0.06，P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、

11、IL-1β和IL-6水平均顯著升高(P<0.01)，但mRNA上調(diào)幅度和細(xì)胞因子水平升高幅度均小于對(duì)照組(P<0.05)。在LPS+2實(shí)驗(yàn)中，干擾組細(xì)胞MD-2 mRNA、TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表達(dá)量與LPS未刺激組比較均未見上調(diào)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-1β和IL-6水平亦未見升高(P>0.05)。
　　結(jié)論：MD-2在LPS所致的大鼠ALI中起重要作用。LPS刺激可引起大鼠肺泡巨噬細(xì)胞MD-2和TL