鯉皰疹病毒2型ddPCR檢測(cè)方法的建立及其抗體庫(kù)的篩選.pdf

1、鯉皰疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2），是一種高致病性雙鏈DNA病毒。因該病毒是第2個(gè)分離自鯉科魚(yú)類(lèi)的皰疹病毒，國(guó)際病毒系統(tǒng)分類(lèi)與命名委員會(huì)(ICTV)將其命名為鯉皰疹病毒2型，該病毒屬于魚(yú)皰疹病毒科（Alloherpesviridae），鯉皰疹病毒屬（Cyprinivirus）。本研究建立了定量檢測(cè)CyHV-2的微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)方法，并且與實(shí)時(shí)熒

2、光定量PCR(real-timequantitative PCR，RT-qPCR)方法就其靈敏性、特異性、重復(fù)性和臨床樣品檢測(cè)作了比較分析。結(jié)果表明，與RT-qPCR相比，ddPCR具有相同的特異性，其靈敏性比RT-qPCR方法低20倍。在定量CyHV-2 DNA時(shí)，ddPCR(R2=0.994)和RT-qPCR(R2=0.994)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，并且這兩種檢測(cè)方法的定量值呈正相關(guān)(R2=0.989)。但是，在定量檢測(cè)相同稀釋度

3、CyHV-2 DNA時(shí)，RT-qPCR的定量值始終比ddPCR高10倍。ddPCR的組內(nèi)和組間重復(fù)變異系數(shù)(CV)各為0.59％-11.26％和6.55％-23.21％，而RT-qPCR各為16.57％-27.56％和22.31％-56.73％，說(shuō)明ddPCR具有更好的穩(wěn)定性。在臨床樣品定量檢測(cè)時(shí)，ddPCR的檢出率稍高于RT-qPCR。本研究建立的ddPCR能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)CyHV-2，將為CyHV-2相關(guān)研究提供有益參考。
　

4、　為獲得可檢測(cè)CyHV-2的單鏈抗體，本研究利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，經(jīng)過(guò)4輪淘選富集后獲得2株抗CyHV-2單鏈抗體(scFv)。Dot blot結(jié)果分析表明，2個(gè)可溶性單鏈抗體均能特異性識(shí)別CyHV-2; Western blot結(jié)果顯示，2個(gè)可溶性單鏈抗體的分子量約為27 kDa。由免疫組化試驗(yàn)結(jié)果可知2個(gè)可溶性單鏈抗體均能檢測(cè)到CyHV-2在肝組織和鰓組織中的分布。ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明可溶性單鏈抗體均不與CyHV-3、EHNV、C