C57BL-6小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中SOCS1-JAK2-STAT3信號(hào)通路作用機(jī)制的探討.pdf

1、目的:探討SOCS1-JAK2-STAT3通路在C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病中的作用機(jī)制，進(jìn)一步確立SOCS1-JAK2-STAT3通路在MS中的治療作用。
　　 方法:將60只雌性，6-8周齡，體重在18-22g之間的C57BL/6小鼠隨機(jī)分組為:EAE+AG490組、EAE模型組和空白對(duì)照組。本研究采用以300μg人工合成MOG35-55多肽溶于200μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，再與等量含4mg/ml卡介苗

2、的完全福氏佐劑(CFA)充分混合至油包水乳劑，制成完全抗原，雙側(cè)側(cè)腹壁分4點(diǎn)皮下注射。兩組均于免疫后第0和48h腹腔內(nèi)注射500ng百日咳毒素，建立相應(yīng)模型方法免疫C57BL/6小鼠制備EAE模型，應(yīng)用AG490進(jìn)行干預(yù)。空白對(duì)照組則直接將200μlPBS與等量CFA乳化免疫動(dòng)物。EAE+AG490組于免疫后第3、5、7、9、11、13、15、17、19天給予AG4901mg皮下注射至處死，空白對(duì)照組和EAE模型組于免疫后第3、5、7、

3、9、11、13、15、17、19天給予生理鹽水0.1ml小鼠皮下注射。觀察藥物對(duì)動(dòng)物臨床表現(xiàn)的影響，參照通用的臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。于免疫后第13天各組隨機(jī)取材，記為發(fā)病前組，并于各組約為免疫后第20天記為高峰組，分別隨機(jī)取材，記為發(fā)病高峰組。將各實(shí)驗(yàn)組小鼠按不同時(shí)期處死后取胸腺進(jìn)行HE染色觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察RORγt、IL-17、SOCS1、P-STAT3陽(yáng)性細(xì)胞的分布并計(jì)數(shù)，進(jìn)行比較。

4、采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)病率用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，多組計(jì)量資料均數(shù)的比較應(yīng)用ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)方差不齊(P＜0.1)時(shí)，用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.動(dòng)物發(fā)病情況的觀察
　　 小鼠在免疫后漸漸出現(xiàn)精神狀態(tài)改變，表現(xiàn)為萎靡，飲食不佳，體重減輕，皮毛光滑度也隨之

5、降低，發(fā)病時(shí)小鼠先出現(xiàn)尾部張力減低消失，繼而出現(xiàn)后腿、前腿的無(wú)力，甚至大小、便失禁，多數(shù)小鼠還伴有雙后腿關(guān)節(jié)的腫脹。
　　 (1)開(kāi)始發(fā)病時(shí)間的比較:EAE組小鼠平均起病時(shí)間為(11.0000±1.684)天，EAE+AG490組起病時(shí)間延長(zhǎng)，為(17.3333±0.750)天，此二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 (2)小鼠發(fā)病率的比較:EAE組20只大鼠中發(fā)病20只，發(fā)病率100％，EAE+AG490組20

6、只小鼠中發(fā)病的有9只，發(fā)病率為45％，此二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 (3)神經(jīng)系統(tǒng)功能評(píng)分比較:EAE組免疫后20天(4.0000±0.12566)。EAE+AG490組免疫后20天(2.0556±0.24216)。兩組在同一時(shí)間點(diǎn)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 此二組動(dòng)物發(fā)病情況比較:EAE+AG490組平均發(fā)病時(shí)間明顯低于EAE組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);EAE+AG490組免疫后

7、20天平均評(píng)分低于EAE組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);EAE+AG490組發(fā)病率低于EAE組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 2.組織病理學(xué)觀察:
　　 (1)對(duì)照組皮質(zhì)髓質(zhì)分界清楚，淋巴細(xì)胞密集，核呈藍(lán)紫色。
　　 (2)免疫后第13天EAE組和EAE+AG490組胸腺細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，胸腺組織開(kāi)始萎縮，皮質(zhì)開(kāi)始變薄，淋巴細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞松散，核染色質(zhì)有所濃縮，核開(kāi)始固縮。
　　 (3)免疫后

8、第20天EAE組出現(xiàn)凋亡細(xì)胞更多，呈現(xiàn)顯著的胸腺萎縮，皮質(zhì)明顯變薄，淋巴細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞松散，凋亡細(xì)胞數(shù)增多，核染色質(zhì)濃縮，核固縮，比EAE+AG490組病理表現(xiàn)嚴(yán)重。
　　 3.免疫組化染色指標(biāo)觀察
　　 3.1.RORrt免疫組化染色
　　 廣泛表達(dá)于淋巴器官間隔細(xì)胞（成為CD4+CD8+T雙陽(yáng)性細(xì)胞）。
　　 (1)免疫第13天EAE組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比EAE+AG490組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，

9、兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 (2)免疫后第20天EAE組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比EAE+AG490組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 (3)EAE組2個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較:免疫后13天組與免疫后20天組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 (4)EAE+AG490組2個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較:免疫后13天組與免疫后20天組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.2.

10、IL-17免疫組化染色
　　 IL-17是目前新發(fā)現(xiàn)的由CD4+記憶T淋巴細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。
　　 (1)免疫后第13天EAE組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比EAE+AG490組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.0S)。
　　 (2)免疫后第20天EAE組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比EAE+AG490組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。

11、>　　 (3)EAE組2個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較:免疫后13天組與免疫后20天組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 (4)EAE+AG490組2個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較:免疫后13天組與免疫后20天組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 3.3.SOCS1
　　 SOCS1蛋白廣泛表達(dá)于各種人體細(xì)胞。
　　 (1)免疫后第13天EAE組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比EAE+AG490組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義(P＜0.05）。
　　 (2)免疫后第20天EAE組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比EAE+AG490組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 (3)EAE組2個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較:免疫后13天組與免疫后20天組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 (4)EAE+AG490組2個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較:免疫后13天組與免疫后20天組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.4.p-STAT3

13、r>　　 P-STAT3蛋白廣泛表達(dá)于人體各種細(xì)胞。
　　 (1)免疫后第13天EAE組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比EAE+AG490組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 (2)免疫后第20天EAE組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比EAE+AG490組免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 (3)EAE組2個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較:免疫后13天組與免疫后20天組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(