人真皮成纖維細胞在凝血酶和炎癥因子影響下釋放MMP-9及信號通路的研究.pdf

1、背景：
　　皮膚損傷愈合是一個復(fù)雜連續(xù)的生物過程，包括凝血、炎癥細胞的浸潤、炎癥介質(zhì)的釋放、細胞的增殖及結(jié)締組織的形成，深達真皮的損傷最終以瘢痕形式愈合。凝血酶作為損傷后的早期效應(yīng)因子，參與凝血后，在損傷愈合的其他階段也發(fā)了重要作用。明膠酶（包括MMP-2和MMP-9）屬于金屬蛋白酶成員，能降解Ⅳ型膠原及多種細胞外基質(zhì)成份，在皮膚損傷愈合過程中發(fā)揮重要作用。愈合過程中有多種炎癥因子參與，如：IL-1β、TNF-α等。
　　真

2、皮成纖維細胞是最主要的皮膚創(chuàng)傷修復(fù)細胞，能產(chǎn)生膠原及金屬蛋白酶等。蛋白酶激活受體（Protease-activated-receptorPAR）是G蛋白偶聯(lián)受體，凝血酶可通過激活此受體發(fā)揮多種生物效應(yīng)，而且不同來源的成纖維細胞可表達不同亞型的蛋白激酶受體，我們之前的研究已經(jīng)證實成人真皮成纖維細胞高表達PAR1，弱表達PAR2，較強表達PAR3，不表達PAR4。胚胎真皮成纖維細胞上蛋白酶激活受體的表達情況尚了解甚少。
　　我們之前研

3、究結(jié)果顯示凝血酶可通過激活PAR1，經(jīng)JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進成纖維細胞分泌MMP-9。而真皮成纖維細胞在凝血酶與炎癥因子IL-1β、TNF-α單獨或聯(lián)合激發(fā)下釋放MMP-9的情況及其信號通路機制，目前尚不清楚。
　　人們很早發(fā)現(xiàn)了胚胎皮膚損傷的無瘢痕愈合，而且已經(jīng)證實胚胎皮膚與成人皮膚存在很大差異。胚胎真皮成纖維細胞作為損傷修復(fù)的主要效應(yīng)細胞也具有獨特的功能。大量研究證明胚胎成纖維細胞處于不同的細胞因子網(wǎng)格之中。體外

4、相同壞境下，胚胎和成人真皮成纖維細胞分泌MMP-9的情況的研究，可使我們進一步了解胚胎真皮成纖維細胞在瘢痕愈合中的作用，所以本實驗研究胚胎成纖維細胞在凝血酶與炎癥因子IL-1β、TNF-α單獨或聯(lián)合激發(fā)下釋放MMP-9的情況、其信號機制及其與成人真皮成纖維細胞在同樣條件下釋放MMP-9情況及其信號機制的異同。
　　目的：
　　研究成人和胚胎真皮成纖維細胞在凝血酶和IL-1、TNF等炎癥因子單獨/聯(lián)合刺激作用下MMP-9的釋放

5、和信號通路參與狀況，分析兩者之間有無區(qū)別。
　　方法：
　　經(jīng)病人同意后，取第一附屬醫(yī)院外科行包皮環(huán)切術(shù)切除的皮膚和產(chǎn)科引產(chǎn)胚胎（20周內(nèi)）的皮膚，進行人真皮成纖維細胞的分離、純化和培養(yǎng)，取3～6代之間的成纖維細胞用于以下實驗：
　?。?）RT-PCR和實時熒光定量PCR，測定人真皮成纖維細胞對PAR的表達情況。
　?。?）明膠酶譜檢測凝血酶、IL-1β、TNF-α單獨或聯(lián)合作用下人真皮成纖維細胞釋放明膠酶的情況

6、。
　?。?）免疫印跡檢測MAPK通路下游產(chǎn)物的情況，實時定量PCR檢測抑制劑作用下成纖維細胞表達MMP-9mRNA情況。
　　結(jié)果：
　?。?）RT-PCR和定量PCR檢測均顯示成人原代成纖維細胞高表達PAR-1，較高表達PAR-3，弱表達PAR-2。胚胎皮膚成纖維細胞高表達PAR-1和PAR-2，弱表達PAR-3，不表達PAR-4。
　?。?）成人真皮成纖維細胞經(jīng)過凝血酶、IL-1β、TNF-α單獨作用后，上

7、清中MMP-9較對照組明顯增高；經(jīng)凝血酶與IL-1β或TNF-α聯(lián)合作用后，上清中MMP-9水平較對照組增高；凝血酶、IL-1β、TNF-α三者聯(lián)合作用時上清中MMP-9水平較對照組明顯減低。TNF-α單獨或與IL-1β聯(lián)合作用時，不影響細胞釋放MMP-9。
　?。?）胚胎真皮成纖維細胞經(jīng)過凝血酶、IL-1β單獨或聯(lián)合作用后，上清中MMP-9活性較對照組明顯增高；凝血酶與IL-1β或TNF-α聯(lián)合作用時，胚胎真皮成纖維細胞分泌MM

8、P-9較對照組增加；凝血酶、IL-1β、TNF-α三者聯(lián)合作用時分泌MMP-9較對照組明顯減少；TNF-α單獨或與IL-1β聯(lián)合作用時，MMP-9較對照組無明顯變化。
　?。?）兩種細胞經(jīng)PD98059孵育30min后，再加入凝血酶、IL-1β、TNF-α單獨或協(xié)同作用15min、2h、6h后，成人成纖維細胞分泌MMP-9減少，表達MMP-9mRMA及MAPK下游產(chǎn)物ERK1/2均較對照組減少；胚胎真皮成纖維細胞分泌MMP-9及M

9、APK下游產(chǎn)物ERK1/2較對照組無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　（1）成人與胚胎真皮成纖維細胞PARs的表達存在差異。成人真皮成纖維細胞弱表達PAR-2，而胚胎真皮成纖維細胞高表達PAR-2。
　?。?）凝血酶、IL-1β及TNF-α單獨可誘導(dǎo)成人真皮成纖維細胞釋放MMP-9增加；凝血酶與IL-1β或TNF-α聯(lián)合作用時刺激成人成纖維細胞釋放MMP-9增加；IL-1β與TNF-α聯(lián)合作用時，對成人真皮成纖維細胞釋放MM

10、P-9無明顯影響。三者聯(lián)合作用時減少成纖維細胞釋放MMP-9。
　?。?）凝血酶和IL-1β單獨作用于胚胎真皮成纖維細胞，細胞釋放MMP-9增加；凝血酶與IL-1β或TNF-α聯(lián)合作用時，胚胎成纖維細胞釋放MMP-9增加；TNF-α單獨或與IL-1β聯(lián)合作用時，胚胎真皮成纖維細胞釋放MMP-9無明顯變化。三者聯(lián)合作用時，胚胎成纖維細胞釋放MMP-9明顯減少。
　　（4）凝血酶與炎癥因子（IL-1β、TNF-α）聯(lián)合作用于成人