七氟烷預(yù)處理對缺氧大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生存、功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、器官缺血可以引起實(shí)質(zhì)細(xì)胞不可逆性的丟失，是導(dǎo)致殘疾與死亡的一個(gè)主要原因。因此，有許多方法被研究用來治療此類疾病，而近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療獲得了極好的療效，引起越來越多的人關(guān)注與研究。
　　 隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療尚存在著諸多問題。其中較為嚴(yán)峻的是，移植后的干細(xì)胞的生存及功能都面臨著極大威脅。文獻(xiàn)報(bào)道心肌缺血干細(xì)胞移植治療中，移植后進(jìn)入體內(nèi)的干細(xì)胞在第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)存活率低于1％，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，直接注入到心肌梗

2、死區(qū)的標(biāo)記BMSCs僅散在分布于分化良好、結(jié)構(gòu)完整的大血管壁內(nèi)和成熟心肌之間而不在或偶在肉芽組織替代的梗死區(qū)（此區(qū)域內(nèi)血管稀少，血液供應(yīng)最差）和其毛細(xì)血管周圍（原缺血區(qū)，血液供應(yīng)較差）出現(xiàn)，而細(xì)胞之間并不出現(xiàn)培養(yǎng)條件下以種子細(xì)胞為中心的擴(kuò)展性增殖，在梗死區(qū)域BMSCs并不充分出現(xiàn)心肌細(xì)胞表型，這些結(jié)果均提示區(qū)域性缺氧環(huán)境不利于BMSCs生存，同時(shí)影響其增殖和遷移等功能。由此，如何增加惡劣環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生存及功能成為干細(xì)胞移

3、植的一項(xiàng)亟待解決的問題及研究的熱點(diǎn)。
　　 體外缺氧預(yù)處理借鑒于經(jīng)典缺血預(yù)處理的理念，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其能夠有效地降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺氧/血清剝奪，糖氧剝奪，氧化應(yīng)激等復(fù)制體內(nèi)缺氧環(huán)境惡性刺激引起的損傷，而一些藥物實(shí)施的藥理學(xué)預(yù)處理也被證明能復(fù)制缺氧預(yù)處理保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用。
　　 七氟烷是目前臨床上一種廣泛應(yīng)用的吸入性麻醉藥。近年來，研究不斷證實(shí)，七氟烷預(yù)處理或后處理對多種組織細(xì)胞缺血再灌注均有保護(hù)作用，如心肌，腦及

4、脊髓神經(jīng)細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等。最近，有報(bào)道稱，低濃度的七氟烷短暫預(yù)處理人干細(xì)胞樣內(nèi)皮祖細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中能促進(jìn)其集落形成，提高其增殖能力，并有另一篇報(bào)道稱，七氟烷預(yù)處理促進(jìn)了帶有內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)記CD34+， flk-1+的細(xì)胞向外周血移動(dòng)。但未見文獻(xiàn)報(bào)道七氟烷預(yù)處理對缺血微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響的相關(guān)研究。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過體外復(fù)制干細(xì)胞移植后缺血組織的缺血缺氧微環(huán)境，旨在探討七氟烷預(yù)處理對嚴(yán)重缺氧環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干

5、細(xì)胞生存、遷移、分泌功能的影響及預(yù)處理后的間充質(zhì)干細(xì)胞降低神經(jīng)樣細(xì)胞PC12細(xì)胞缺血損傷的作用，Western Blot分析HIF-1α，Akt及p-Akt的表達(dá)探討預(yù)處理的可能機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、七氟烷預(yù)處理對缺氧大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生存、遷移、分泌功能的影響
　　 采取全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析表面標(biāo)記CD29、CD45、CD44、CD34，進(jìn)行成骨、成脂分化鑒定

6、。采用厭氧發(fā)生器建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外缺氧并行血清剝奪以模擬體內(nèi)缺血環(huán)境建立細(xì)胞體外缺氧模型，應(yīng)用吸入性麻醉藥七氟烷進(jìn)行預(yù)處理，摸索預(yù)處理?xiàng)l件。選取生長狀態(tài)良好的P3細(xì)胞隨機(jī)分為3組:正常對照組(N)、缺氧血清剝奪組(H/SD)、2％七氟烷預(yù)處理2小時(shí)組(SPC)，對各組細(xì)胞行胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，Annexin-Ⅴ/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測凋亡率;利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移能力的變化;收集各組細(xì)胞進(jìn)行Weste

7、rn Blot分析VEGF的表達(dá)，收集上清液進(jìn)行ELISA分析VEGF的濃度。
　　 二、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對缺氧PC12的生存率的影響
　　 通過對神經(jīng)樣細(xì)胞PC12行低氧血清剝奪處理建立神經(jīng)元缺血損傷的體外模型，采用Transwell小室共培養(yǎng)方法建立BMSCs與PC12細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。選取生長良好的PC12細(xì)胞隨機(jī)分為四組:正常對照組、H/SD組，BMSCs共培養(yǎng)+H/SD組、SP-BMSCs共培養(yǎng)+H/SD組

8、，對各組細(xì)胞行胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，Annexin-Ⅴ-FITC標(biāo)記后流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12細(xì)胞的凋亡情況。
　　 三、七氟烷預(yù)處理對缺氧大鼠骨髓間充質(zhì)千細(xì)胞HIF-1α、Akt及p-Akt的表達(dá)的影響
　　 選取生長狀態(tài)良好的P3細(xì)胞隨機(jī)分為3組:正常對照組(N)、缺氧血清剝奪組(H/SD)、2％七氟烷預(yù)處理2小時(shí)組(SPC)，Western Blot分析嚴(yán)重缺氧環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及七氟烷預(yù)處理中HIF-1α

9、、Akt及p-Akt的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、分離培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞呈成纖維狀貼壁生長，第3代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞檢測CD29為90.5％、CD90為94.7％、CD34為1.9％、CD45為3.6％，細(xì)胞能向脂肪、骨細(xì)胞分化。
　　 與正常組比較，24小時(shí)缺氧與血清剝奪夠顯著增加大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Annexin-Ⅴ陽性細(xì)胞比率(21.39±3.17％，vs正常培養(yǎng)組4.33±1.23％，P＜0.05);與

10、缺氧組比較，七氟烷預(yù)處理能降低Annexin-Ⅴ陽性細(xì)胞比率(11.00±1.50％，vsH/SD組， P＜0.05);
　　 缺氧組，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)遷移數(shù)量顯著降低(vs正常培養(yǎng)組，P＜0.05);2％七氟烷預(yù)處理能部分逆轉(zhuǎn)缺氧引起的遷移數(shù)量減少(vs H/SD組，P＜0.05);
　　 與正常培養(yǎng)的BMSCs對照組比較，H/SD組VEGF表達(dá)量較正常對照組增加，而與H/SD組比較，七氟烷預(yù)處理組表

11、達(dá)量及上清VEGF濃度增加。
　　 2、正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞凋亡率低(9.89±0.44％); H/SD組，PC12細(xì)胞凋亡明顯增加(82.85±3.34％，vs正常培養(yǎng)組，P＜0.05);與BMSCs共培養(yǎng)后PC12細(xì)胞凋亡率降低(59.87±2.88％，vs H/SD組，P＜0.05);而與SP-BMSCs共培養(yǎng)后其凋亡率進(jìn)一步降低(44.84±2.16％，vs H/SD組和BMSCs組，P＜0.05)。
　　 3

12、、Western Bloting檢測結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)的BMSCs對照組比較，H/SD組HIF-1α增加，而與H/SD組比較，七氟烷預(yù)處理組表達(dá)量進(jìn)一步增加;H/SD組p-Akt/Akt表達(dá)比例較正常對照組降低，七氟烷預(yù)處理組p-Akt/Aktb表達(dá)比例增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.全骨髓貼壁法可以成功分離并獲得大量純度較高的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;長時(shí)間嚴(yán)重缺氧與血清剝奪能誘發(fā)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，2％七

13、氟烷預(yù)處理2小時(shí)能顯著降低缺氧血清剝奪引起的凋亡;嚴(yán)重缺氧環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力顯著降低，七氟烷預(yù)處理能提高嚴(yán)重缺氧環(huán)境下的遷移能力;七氟烷預(yù)處理能顯著增加嚴(yán)重缺氧環(huán)境下BMSCs的VEGF表達(dá)及分泌;
　　 2.七氟烷預(yù)處理后的較之未經(jīng)預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效的降低缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡;
　　 3.七氟烷預(yù)處理能逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的引起的p-Akt/Akt表達(dá)比例降低，在低氧基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加HIF-1α