研究轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白化學(xué)修飾在老年性淀粉樣變形成機(jī)制中的作用.pdf

1、目的：轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)主要由肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞和脈絡(luò)叢細(xì)胞合成與分泌，具有轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺素和視黃醇的功能，已證實(shí)其為老年性系統(tǒng)性淀粉樣變(senile systemic amyloidosis，SSA)和家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變(familialamyloidotic polyneuropathy，F(xiàn)AP)患者淀粉樣變的前體蛋白。相關(guān)研究已證實(shí)淀粉樣變成分呈無(wú)分枝纖維狀結(jié)構(gòu)，目前對(duì)于機(jī)體內(nèi)TTR蛋白如何聚合形

2、成淀粉樣變纖維，進(jìn)而沉積于相應(yīng)組織器官的形成機(jī)制還未闡明。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)TTR蛋白化學(xué)修飾與淀粉樣變纖維形成之間關(guān)系的研究，探討TTR代謝組學(xué)在SSA淀粉樣變形成中的作用。
　　 方法：⑴根據(jù)SSA診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集確診SSA患者4例。依據(jù)TTR基因庫(kù)設(shè)計(jì)四對(duì)外顯子引物，PCR擴(kuò)增外顯子，同時(shí)測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)TTR基因是否存在突變。⑵應(yīng)用ProteomeLab PF-2D系統(tǒng)，緩沖液洗脫范圍為pH8.5～4，以pH每變動(dòng)0.3為

3、單位，收集不同pH條件下洗脫的蛋白。⑶采用BCA(BicinchoninicAcid)方法，對(duì)各個(gè)組分蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。⑷利用硫磺素T(Thioflavin-T，ThT)能夠與淀粉樣變成分特異性結(jié)合的性質(zhì)，對(duì)各個(gè)收集組分的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。⑸采用抗人-TTR抗體，Dot blot檢測(cè)各個(gè)收集組分中的TTR蛋白。⑹利用超高效液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquidchromatography c

4、oupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry,UPLC/Q-TOF MS)技術(shù)，解析血清中TTR蛋白代謝組學(xué)修飾特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：①PCR擴(kuò)增結(jié)合基因測(cè)序，分析TTR基因四個(gè)外顯子來(lái)判斷SSA患者TTR基因?yàn)榫窗l(fā)生突變，屬于野生型TTR。②ProteomeLab PF-2D系統(tǒng)分離血清TTR，應(yīng)用連續(xù)pH梯度洗脫，將血清蛋白劃分為46份，同時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白峰度，發(fā)現(xiàn)

5、SSA患者與健康對(duì)照組血清蛋白存在有3個(gè)主要蛋白吸收峰。③BCA蛋白定量檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)兩組間有明顯不同。④硫磺素T特異檢測(cè)淀粉樣變熒光強(qiáng)度試驗(yàn)，在pH7.8～6.7和pH5.6～4.8部分熒光強(qiáng)度增高，同時(shí)TTR免疫反應(yīng)陽(yáng)性說(shuō)明存在淀粉樣變熒光成分。⑤Dot blot鑒定TTR蛋白存在的范圍，發(fā)現(xiàn)SSA患者pI7.83～7.61之間TTR含量較高、對(duì)照組在pI7.95～7.72范圍TTR含量較多，提示兩者間TTR蛋白存在化學(xué)修飾差異。⑥超

6、高效液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF MS)技術(shù)解析分析TTR化學(xué)修飾，SSA患者TTR修飾類型Dehydration ST、Phosphoryl STY、Hydroxyl DKNP、Carbamidomethyl C、Phosphopantetheine S和O-GlcNac ST明顯減少。
　　 結(jié)論：⑴利用PF-2D技術(shù)，依據(jù)蛋白質(zhì)在系統(tǒng)梯度中所呈現(xiàn)的電荷極性洗脫蛋白，在不影響淀粉樣變纖維結(jié)構(gòu)的pH

7、條件下梯度洗脫收集血清TTR蛋白，為進(jìn)一步研究TTR蛋白代謝修飾與淀粉樣變纖維形成模型奠定基礎(chǔ)。⑵發(fā)現(xiàn)SSA患者血清TTR蛋白修飾類型，Dehydration ST、Phosphoryl STY、Hydroxyl DKNP、Carbamidomethyl C、Phosphopantetheine S和O-GlcNac ST修飾減少，而Th-T結(jié)合實(shí)驗(yàn)熒光強(qiáng)度增高。TTR蛋白4個(gè)單體間依靠疏水結(jié)構(gòu)吸引彼此形成聚合體，表面為親水基團(tuán)，上述修