耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥機制與金屬酶、整合子的關系研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)廣泛存在于自然界，也是臨床上重要的條件致病菌，在引起院內(nèi)感染的病原菌分離率中位居前列，且經(jīng)常檢出多重耐藥株。亞胺培南是迄今為止開發(fā)的抗菌藥物中抗菌譜最廣、抗菌作用最強的一類碳青霉烯類抗生素，大多數(shù)革蘭陰性桿菌都對其敏感，隨著碳青霉烯類藥物使用的越來越廣泛，細菌對其耐藥的情況也逐年增多，耐亞胺培南的耐藥株往往導致在臨床上無藥可治的地步。產(chǎn)金屬酶(Metallo-β-Lact

2、amases， MBL)是細菌耐碳青霉烯類抗生素主要機制之一，MBL基因可以位于整合子上，通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子的移動在同種和不同種類的細菌間傳播。MBL中臨床最常見的是IMP-1和1VIM-2亞型，整合子中臨床最常見的是第一類整合子。本研究的目的是探討耐亞胺培南PA臨床分離株中MBL，的攜帶情況及在耐藥中的作用，研究第一類整合子在產(chǎn)MBL銅綠假單胞菌中的分布以及基因盒的攜帶情況，為細菌耐藥傳播的研究學提供流行病學基礎資料。 本研究收

3、集了72株臨床分離的PA，分離科室最多的前三位是： ICU病房、呼吸科和外科，對AMK的耐藥率最低，為31.9％。其中61株對亞胺培南耐藥，耐藥率為84.7％。采用瓊脂平板對倍稀釋法對其中的耐亞胺培南的42株PA做藥敏實驗。發(fā)現(xiàn)耐藥率由低到高的分別為：AMK(31.O％)、CAZ(38.1％)、CIP(47.6％)、PIP(64.3％)。接著將這42株菌做平板CAZ-MPE紙片協(xié)同實驗，CAZ和MPE紙片圓心距離為1.O～2.5cm，兩

4、個CAZ紙片間圓心距離為4.5cm。觀查兩者抑菌圈靠近處有無直徑擴大的協(xié)同現(xiàn)象：陽性結(jié)果的有27株，共7種表型，為首次對協(xié)同現(xiàn)象的結(jié)果進行細致分型。對所有菌株進行MBL基因IMP-1和VIM的PCR檢測，VIM的陽性株進一步進行VIM-1以及VIM-2基因的PCR檢測。72株PA中發(fā)現(xiàn)55株攜帶有VIM型MBL基因，攜帶率為76％，進一步的亞型檢測中未發(fā)現(xiàn)VIM-1型基因，只發(fā)現(xiàn)一株攜帶VIM-2基因。這55株查出攜帶VIM基因的PA中

5、有53株PA對亞胺培南耐藥，2株對亞胺培南敏感，可見含有.MBL基因未必就表達為耐藥。11株對亞胺培南耐藥的PA未查見含有MBL基因，推斷是因為耐亞胺培南還可以通過其它耐藥機制來表達，比如OprD蛋白的缺失、外排泵的高度表達等。這55株之外的一株檢出攜帶IMP-1型MBL基因。對于耐亞胺培南的61株PA，MBL基因攜帶率則為87％。紙片協(xié)同實驗陽性結(jié)果的27株中，一株檢出攜帶IMP-1型基因，一株檢出攜帶VIM-2型基因，其余的25株的

6、VIM基因PCR檢測都是陽性結(jié)果。 本研究為首次在中國西南地區(qū)發(fā)現(xiàn)IMP-1型MBL基因。PA9917的IMP-L 基因PCR檢測為陽性，PCR產(chǎn)物測序得906個堿基，在GenBank上比對與產(chǎn)IMP-1酶PA的編碼基因(注冊號：AY251052.1)同源性為100％，即可確認為工MP-1金屬酶基因。經(jīng)PCR檢測和測序比對，確認含有第一類整合酶基因(與DQ219465.1的含有第一類整合子PA同源性為100％)以及約1800bp

7、大小的第一類整合子基因盒。但是第一類整合子的基因盒測序結(jié)果未見MBL基因；GenBank上比對與多種細菌包括：肺炎克雷伯菌、枸櫞酸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷菌、沙門菌亞屬菌均為100&同源，包含有aadA2基因，它編碼二氫葉酸還原酶，鏈霉素/大觀霉素3’磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶。說明不同菌屬的菌株可含有完全相同的整合子基因盒。與PA(注冊號：ABl91047.1)同源性為99％，它也含有二氫葉酸還原酶，鏈霉素/大觀霉素 3’磷酸腺苷

8、轉(zhuǎn)移酶的基因，在ABl91047.1的859位為 G，對應氨基酸為L(亮氨酸)；而本實驗所測為A，對應氨基酸為F(苯丙氨酸)。由于所在的開放讀碼框編碼的是未知功能的蛋白，所以此突變是否有意義仍未知，有待進一步研究。PA 9917提取質(zhì)粒實驗為陽性結(jié)果，但是進行質(zhì)粒的IMP-1 基因PCR檢查結(jié)果為陰性，推斷可能是因為IMP-1基因位于染色體上。本研究也是首次在中國西南地區(qū)發(fā)現(xiàn)VIM型MBL基因。PA 895攜帶VIM基因，經(jīng)VIM-2基

9、因PCR檢測為陽性結(jié)果，產(chǎn)物純化后測序網(wǎng)上比對，與注冊號DQ522236.1的銅綠假單胞菌同源性為100％，確認PA 895產(chǎn)VIM-2型MBL。但是第一類整合子PCR檢測、質(zhì)粒提取實驗均為陰性結(jié)果。質(zhì)粒提取為陰性結(jié)果，可能是VIM-2基因所在的質(zhì)粒太大沒有提取出來，也可能是本次檢測出的VIM-2基因不在質(zhì)粒上，在染色體上。 PA 9917和PA 895都對亞胺培南耐藥；CAZ和2-MPE的紙片協(xié)同實驗結(jié)果都是陽性；瓊脂平板對倍

10、稀釋藥敏實驗都是除了對環(huán)丙沙星敏感外，其余都耐藥的高耐菌株。PA 9917對亞胺培南的MIC為32μg/mL，PA 895則高達512μg/mL，而亞胺培南耐藥的標準是MIC大于8μg/mL；對于頭孢他啶的MIC分別為64u g/mL和128μg/mL，皆為高度耐藥。 本研究為首次對耐亞胺培南且產(chǎn)MBL的PA中第一類整合子及基因盒的攜帶情況作一調(diào)查。56株MBL基因PCR陽性PA中，26株攜帶有第一類整合酶基因，所以第一類整合子

11、的檢出率為46.4％。在這26株中又只有18株含有第一類整合子基因盒，第一類整合子陽性株中基因盒的攜帶率為69.2％(18株/26株)，基因盒擴增產(chǎn)物可根據(jù)電泳圖譜分為5種型別。55株為VIM陽性株，其中25株檢出含有第一類整合子，這25株PA中又只有17株含有第一類整合子基因盒；1株產(chǎn)IMP-1的PA含有第一類整合酶基因與第一類整合子基因盒。它的IntIl整合酶基因PCR產(chǎn)物純化測序得906個核苷酸，在GenBarlk上進行比對，與含

12、有第一類整合子的PA基因(注冊號：DQ219465.1)同源性為100％。接著進行第一類整合子基因盒擴增產(chǎn)物的測序，得1836個核苷酸，比對與肺炎克雷伯菌(注冊號：AY7484-53.1)100％同源，包含有aadA2基因，它編碼二氫葉酸還原酶，鏈霉素／大觀霉素3’磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶。但是GenBank上比對與PA(注冊號： ABl91047.1)同源性為99％，在ABl91047.1的859位為G，對應氨基酸為L(亮氨酸)；而本實驗所測為

13、A，對應氨基酸為F(苯丙氨酸)。由于所在的開放讀碼框編碼的是未知功能的蛋白，所以此突變是否有意義仍未知，有待進一步研究。 發(fā)現(xiàn)一種突變的第一類整合子基因盒：耐亞胺培南且紙片協(xié)同實驗陰性的PA 9576的第一類整合酶PCR檢測為陽性結(jié)果，接著進行第一類整合子基因盒的檢測發(fā)現(xiàn)：與第一類整合子基因(注冊號為 ABl89979.1，PA)同源性為98％，含有二氫葉酸還原酶、aadA5基因，突變堿基對應的基因功能為編碼二氫葉酸還原酶。6個

14、氨基酸突變位點如下：101(D-N)、117(T-S)、118(V-G)、120(V-D)、121(E-K)、122(V-L)，突變的意義未知，有可能影響葉酸代謝從而影響細菌核酸和蛋白質(zhì)的合成；又因為磺胺類藥物的作用機制就是作為二氫葉酸還原酶的競爭性抑制劑，所以推斷突變與磺胺耐藥有關，而細菌對磺胺的耐藥性一旦產(chǎn)生就往往是永久性、不可逆的。 本實驗結(jié)果高度提示產(chǎn)PA產(chǎn)MBL和對IMP耐藥關系密切，協(xié)同實驗陽性結(jié)果高度提示菌株產(chǎn)金屬