肝移植術(shù)后膽道“成石”現(xiàn)象與促成核因子——黏蛋白間關(guān)系的初步研究.pdf

1、肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥已成為影響肝移植術(shù)后患者長期存活的重要因素。肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥包括膽管結(jié)石、膽泥、膽管鑄型綜合征等。雖然膽管鑄型物從理化性質(zhì)上與膽管結(jié)石有所區(qū)別，但最終在膽道內(nèi)也形成“結(jié)石”樣物質(zhì)，“成石”現(xiàn)象成為這兩種肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的共同特點，因此在本研究中我們將肝移植術(shù)后并發(fā)膽管結(jié)石和鑄型物視為有“成石”過程的一類膽道并發(fā)癥。 有許多證據(jù)表明膽汁內(nèi)促成核因子—黏蛋白與膽結(jié)石的形成有關(guān)。黏蛋白分為兩類，一類是與上皮

2、細胞相連接的膜結(jié)合型黏蛋白，另一類是由上皮細胞分泌后直接進入管腔內(nèi)的分泌型黏蛋白。黏蛋白呈絲網(wǎng)狀排列，易于吸附膽紅素、膽固醇、脫落細胞等成分，有利于它們的聚積并形成結(jié)石，這樣黏蛋白在結(jié)石形成過程中起著橋梁和骨架樣的作用。 豆蔻酰化富丙氨酸激酶C底物(MARCKS)是蛋白激酶C主要的底物蛋白之一。已證實MARCKS是調(diào)控人呼吸道黏蛋白分泌的關(guān)鍵分子。具有將黏蛋白顆粒與收縮性的細胞骨架蛋白聯(lián)接起來的作用，最終通過胞吐作用將黏蛋白顆粒

3、分泌出胞外。 目前缺血—再灌注損傷仍然是原位肝移植術(shù)中無法回避的病理過程，供肝膽管作為對缺血—再灌注損傷敏感的靶器官，必然要承受熱缺血、冷保存損害及后續(xù)的再灌注過程造成的多重打擊，導(dǎo)致移植器官發(fā)生可逆性和不可逆性的損害。研究發(fā)現(xiàn)肝移植術(shù)后肝組織內(nèi)腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-2、6的表達均有增強，有大量證據(jù)表明多種炎性介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α、氧自由基與促進黏蛋白分泌有關(guān)。因此在本研究中重點關(guān)注了兩個問題，首先是了解黏蛋白與肝移植

4、術(shù)后膽管結(jié)石或鑄型物形成間的關(guān)系，其次是觀察肝移植冷保存時限和缺血—再灌注損傷對黏蛋白分泌的影響。 本研究首先采用化學(xué)定量方法了解到臨床肝移植術(shù)后膽管結(jié)石和鑄型物的成分均以膽紅素為主。經(jīng)掃描電鏡觀察結(jié)石和鑄型物標本，發(fā)現(xiàn)膽固醇性結(jié)晶和膽紅素性顆粒堆積在以黏蛋白為主要成分的基質(zhì)上。本研究采用免疫熒光方法在肝移植術(shù)后結(jié)石和鑄型物冰凍切片標本中檢測到有mucin1和mucin4的存在。另外應(yīng)用Western blot和PCR技術(shù)從蛋白

5、質(zhì)翻譯水平證實，肝移植術(shù)后并發(fā)膽管結(jié)石或膽管鑄型綜合征時，肝膽管系統(tǒng)合成與分泌的黏蛋白明顯增多。因此，mucin1、4與肝移植術(shù)后的“成石”現(xiàn)象有關(guān)，推測黏蛋白可能在肝移植術(shù)后結(jié)石和鑄型物的產(chǎn)生過程中扮演了重要角色。其次本研究建立的Wister大鼠肝移植動脈重建和膽道外引流動物模型，無肝期時間平均為16.6±2.4min，手術(shù)成功率為94.67％，死亡率5.33％，且各袖套管內(nèi)沒有血栓形成，以上結(jié)果表明本方法具有穩(wěn)定性高和重復(fù)性好的特點

6、，是研究肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的理想動物模型。應(yīng)用此模型觀察了不同冷保存時限和術(shù)后不同時相點，對肝移植術(shù)后大鼠肝膽管系統(tǒng)黏蛋白分泌的影響并探討可能的調(diào)控機制。 研究結(jié)果表明大鼠肝移植術(shù)后膽汁內(nèi)黏蛋白的濃度與冷保存時限和術(shù)后時間有關(guān)，在術(shù)后7d達到高峰，尤以CP12組為最。免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察到肝移植術(shù)后大鼠肝膽管組織muein1和mucin4蛋白呈陽性表達，變化趨勢與膽汁內(nèi)黏蛋白的改變一致。另外采用Westernblot和熒光定量

7、PCR技術(shù)分別檢測了大鼠移植肝組織內(nèi)mucin1、4蛋白和mucin1 mRNA的表達水平，結(jié)果顯示蛋白和mRNA表達水平的變化與冷保存時限和術(shù)后時間有關(guān)。因此，冷保存時限和缺血—再灌注損傷是影響大鼠肝移植術(shù)后肝臟黏蛋白合成與分泌的重要因素。 最后本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，肝移植術(shù)后并發(fā)膽管結(jié)石或鑄型綜合征患者以及肝移植術(shù)后大鼠肝組織內(nèi)MARCKS蛋白表達均呈現(xiàn)明顯升高，同時本研究還發(fā)現(xiàn)大鼠肝移植術(shù)后MARCKS蛋白的