淡紫紫孢菌T-DNA插入體庫的構(gòu)建和致病相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum(Thom)Samson)是一種典型的土壤及多種植物根系的習(xí)居菌，不僅可以寄生植物線蟲的卵，而且還可以毒殺植物線蟲幼蟲。除此之外，淡紫紫孢菌還可以降解農(nóng)藥，促進(jìn)植物生長。本論文主要以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)，建立淡紫紫孢菌T-DNA插入突變體庫，通過對突變體表型變化的研究，篩選出對線蟲卵及幼蟲毒力變化的突變菌株?？寺》治隽薢n(Ⅱ)2Cys6轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和磷脂酶D基因與淡

2、紫紫孢菌侵染和殺死線蟲的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)篩選出抗草丁膦基因bar和抗萎銹靈基因CBX,作為抗性標(biāo)記，構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)淡紫紫孢菌遺傳轉(zhuǎn)化體系。其轉(zhuǎn)化條件為:抗性基因為編碼抗草丁膦基因bar和抗萎銹靈基因CBX,淡紫紫孢菌Pl36-1孢子濃度為106孢子/mL，根癌農(nóng)桿菌AGL-1的OD600值為0.2，共培養(yǎng)溫度為25℃，共培養(yǎng)時間為54小時，乙酰丁香酮AS濃度為250μg/mL，搖床轉(zhuǎn)速為120rpm/min

3、。通過對絲核菌531菌株、擬松材線蟲幼蟲、根結(jié)線蟲卵或幼蟲等毒力測定，篩選出了359株表型變異的菌株。對突變體表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)淡紫紫孢菌存在豐富的有益基因資源。
　　(2)通過對耐不同濃度多菌靈的淡紫紫孢菌突變菌株β-tubulin基因克隆和突變位點分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)β-tubulin基因第145(S)，185(T)和200(F)氨基酸同時分別突變?yōu)锳，A和Y時，淡紫紫孢菌耐多菌靈的濃度從0.3μg/mL提高到100μg/mL。生物學(xué)特

4、性和致病性測定等試驗表明β-tubulin基因位點的改變不會影響淡紫紫孢菌形態(tài)學(xué)特征和對線蟲的毒力。同時大田試驗結(jié)果表明β-tubulin基因具有穩(wěn)定的抗性遺傳，可以作為有效的選擇標(biāo)記基因。
　　(3)白灰制菌素對線蟲幼蟲致死有明顯的作用。通過對弱毒力菌株R147的T-DNA插入位點研究發(fā)現(xiàn)Zn(Ⅱ)2Cys6轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白rolP基因正向調(diào)控淡紫紫孢菌白灰制菌素A的合成，而對白灰制菌素B的合成有負(fù)調(diào)控作用。該基因在侵染線蟲的早期過

5、程中上調(diào)表達(dá)。rolP基因的表達(dá)受營養(yǎng)條件或環(huán)境因子的影響。當(dāng)乳糖為碳源（或L-丙氨酸為氮源）時，mRNA相對表達(dá)量最高;同時pH值試驗表明酸性環(huán)境更適合rolP基因表達(dá)。
　　(4)以弱毒力菌株pt386為材料發(fā)現(xiàn)磷脂酶D不僅對線蟲卵寄生有一定作用，而且對線蟲幼蟲致死也有重要作用。當(dāng)磷脂酶D基因pld插入失活，導(dǎo)致淡紫紫孢菌對線蟲的毒力減弱?？寺y序表明該基因含有兩個HKD保守結(jié)構(gòu)域。該基因主要在侵染線蟲早期起降解線蟲卵或幼蟲表

6、皮及細(xì)胞等作用。當(dāng)碳源為麥芽糖或氮源為L-丙氨酸時，有利于pld基因的表達(dá)。同時，酸性環(huán)境(pH4-6)及溫度在27-29℃時，pld基因的表達(dá)水平提高。
　　(5)白灰制菌素D雖然對線蟲毒殺作用不顯著，但是對核盤菌有很強(qiáng)的拮抗抑制作用。通過對菌株pt361研究發(fā)現(xiàn)編碼糖苷水解酶31的基因PGH31對白灰制菌素D有調(diào)控作用。室內(nèi)及大田試驗表明，淡紫紫孢菌菌株對核盤菌有抑制效果，同時可以促進(jìn)油菜增產(chǎn)，是一種防治核盤菌的潛力生防因子。