HA-1077在內(nèi)皮誘導(dǎo)的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞血管新生中的作用.pdf

1、[目的]
　　 ①建立大鼠主動(dòng)脈環(huán)體外培養(yǎng)血管新生實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察新生血管生長的特征和規(guī)律。以Rho激酶抑制劑法舒地爾(HA-1077)為干預(yù)因素，研究HA-1077對(duì)血管新生的影響。②建立大鼠主動(dòng)脈環(huán)與干細(xì)胞共培養(yǎng)血管新生實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究?jīng)內(nèi)皮定向誘導(dǎo)分化的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)動(dòng)脈環(huán)血管新生的影響，以及法舒地爾(HA-1077)的干預(yù)作用。
　　 [方法]
　　 1.HA-1077對(duì)體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈

2、環(huán)血管新生的影響無菌條件下取一段胸主動(dòng)脈，剪為長約1mm的血管環(huán)，隨機(jī)分為對(duì)照組、HA-1077低、中、高濃度組，對(duì)照組血管用HG-DMEM+15％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)，HA-1077組分別在培養(yǎng)液中加入10μmol/L或30μmol/L或60μmol/L HA-1077，每2天換液，每天觀察微血管的生長情況。第5天終止實(shí)驗(yàn)，拍攝微血管生長圖像，計(jì)數(shù)新生的微血管分支數(shù)。同組的血管環(huán)合并，組織勻漿，提取激酶，WesternBlot檢測(cè)ROC

3、KⅠ及ROCKⅡ的表達(dá)。
　　 2.大鼠主動(dòng)脈環(huán)與同種異體、經(jīng)內(nèi)皮誘導(dǎo)的BMSCs體外共培養(yǎng)對(duì)血管新生的影響及HA-1077的干預(yù)作用2.1采用密度梯度離心法，用密度=1.077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液，從大鼠骨髓中分離BMSCs，并于體外純化、擴(kuò)增。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs的表面標(biāo)志CD29、CD106以及CD45。
　　 2.2 EGM-2培養(yǎng)液誘導(dǎo)BMSCs10～14d，傳代后將誘導(dǎo)的BMSCs接種于明膠包被的玻片

4、，分別行Ⅷ因子免疫細(xì)胞化學(xué)和荊豆凝集素免疫熒光染色鑒定。
　　 2.3細(xì)胞增殖試驗(yàn)：按2×103個(gè)/孔將內(nèi)皮誘導(dǎo)的BMSCs接種于96孔板培養(yǎng)24h，更換含刺激因子的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，采用MTT法，酶標(biāo)儀490nm檢測(cè)OD值。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)平行孔4孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 2.4干細(xì)胞標(biāo)記：PBS沖洗2遍，將1mL10mg/mL DiI加入到培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40分鐘，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的標(biāo)記情況。消化細(xì)胞，制備成細(xì)

5、胞懸液，備用。
　　 2.5內(nèi)皮誘導(dǎo)的BMSCs與血管環(huán)共培養(yǎng)：無菌條件下取一段胸主動(dòng)脈，剪為長約1mm的血管環(huán)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、HA-1077低、中、高濃度組，空白對(duì)照組血管用HG-IDMEM+15％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)，不加誘導(dǎo)的BMSCs；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組在空白對(duì)照組的基礎(chǔ)上，加誘導(dǎo)的BMSCs；HA-1077組，在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的基礎(chǔ)上，并分別在培養(yǎng)液中加入10μmol/L，30μmol/L，60μmol/L HA-

6、1077。每2天換液，每天觀察微血管的生長情況。第10天終止實(shí)驗(yàn)，拍攝微血管生長圖像，計(jì)數(shù)新生的微血管分支數(shù)。同組的血管環(huán)合并，組織勻漿，提取激酶，Western Blot檢測(cè)ROCKⅠ及ROCKⅡ的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 1.HA-1077對(duì)體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生的影響與對(duì)照組比較，HA-1077低濃度組新生微血管數(shù)明顯增加，P<0.01；中、高濃度組新生微血管數(shù)較對(duì)照組明顯減少，P<0.01。對(duì)照組和HA

7、-1077低濃度組都有ROCKⅠ和ROCKⅡ表達(dá)，組間比較無明顯差異；HA-1077中、高濃度組則基本未見ROCKⅠ或ROCKⅡ表達(dá)。
　　 2.大鼠主動(dòng)脈環(huán)與同種異體、經(jīng)內(nèi)皮誘導(dǎo)的BMSCs體外共培養(yǎng)對(duì)血管新生的影響及HA-1077的干預(yù)作用2.1 BMSCs培養(yǎng)2d后，部分貼壁細(xì)胞呈梭性，密度均一。7～9d后，貼壁細(xì)胞形成多個(gè)細(xì)胞集落。傳代后BMSCs體積較原代時(shí)明顯增大，呈長梭形，成纖維細(xì)胞樣。流式細(xì)胞術(shù)鑒定，CD106陽

8、性細(xì)胞達(dá)到38.9％，CD29陽性細(xì)胞為80.4％，CD45陽性細(xì)胞達(dá)到29.8％。
　　 2.2經(jīng)EGM-2誘導(dǎo)BMSCs10～14d后，細(xì)胞形態(tài)由長梭形向圓形、短梭形、多邊形轉(zhuǎn)變；細(xì)胞生長至融合后呈鵝卵石樣。內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志，Ⅷ因子和荊豆凝集素試驗(yàn)陽性。
　　 2.3 MTT法檢測(cè)各組內(nèi)皮誘導(dǎo)的BMSCs增殖無顯著差異。
　　 2.4內(nèi)皮誘導(dǎo)的BMSCs與血管環(huán)共培養(yǎng)：與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(只加誘導(dǎo)的

9、BMSCs組)新生微血管數(shù)明顯增加，P<0.01。與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組新生微血管數(shù)明顯減少，P<0.01。各組均有ROCKⅠ和ROCKⅡ表達(dá)，組間比較無明顯差異。
　　 [結(jié)論]
　　 1.小劑量的HA-1077促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈環(huán)的血管新生。大劑量的HA-1077抑制體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈環(huán)的血管新生，此作用與ROCK蛋白質(zhì)表達(dá)抑制有關(guān)。
　　 2.經(jīng)內(nèi)皮誘導(dǎo)的同種異體BMSCs與