膽固醇分子和PI3K-Akt及MAPK-ERK1-2信號通路在牛皰疹病毒1型感染MDBK細胞中的作用研究.pdf

1、牛皰疹病毒1型(Bovine herpesvirus type1,BoHV-1)是牛傳染性鼻氣管炎病(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)的病原體,該病毒感染主要引起呼吸道,消化道,生殖道,眼結膜和神經(jīng)等多組織、器官的炎癥;由該病毒感染引起呼吸道上皮細胞的壞死和免疫抑制導致繼發(fā)曼氏溶血桿菌和睡眠嗜血桿菌感染的發(fā)生而致高死亡率,以及由于生殖道感染而導致的流產(chǎn)對奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。潛伏感染是本病毒

2、重要特點,感染后該病毒在神經(jīng)節(jié)和扁桃體內(nèi)潛伏感染使患牛終生帶毒而成為重要傳染源,在應激或免疫力下降時病毒被激活而發(fā)病,該病在世界各地廣泛分布已經(jīng)給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。
　　 病毒感染靶細胞的過程中需要一些重要細胞分子的幫助才能完成復制周期,同時病毒與細胞相互作用的過程中可能會激活或抑制細胞的某些重要的信號傳導通路,因此開展相應的基礎研究尋找BoHV-1感染MDBK細胞的過程中涉及的關鍵分子和信號通路,對于揭示病毒與細胞相互作

3、用的關系,從而解析該病毒的感染機理,甚至對于新藥物的研發(fā)設計都具有重要意義。
　　 Lipid rafts是大量分布于細胞膜上具有多種生物學功能的特定結構,主要由膽固醇、糖苷鞘磷脂、鞘磷脂和磷脂等成分緊密結合有序排列而構成;該結構穩(wěn)定存在于脂質(zhì)雙層細胞膜上,主要參與跨膜運輸、胞吞和胞吐過程中蛋白質(zhì)的分選,細胞粘附和遷移,細胞凋亡,突觸傳遞,細胞骨架的組織等多種生物學功能。最近研究發(fā)現(xiàn)Lipid rafts與多種病原微生物的感染有

4、關,而膽固醇作為該結構的重要成分是否參與了BoHV-1感染MDBK細胞的過程值得探索并深入研究。
　　 膽固醇分子是Lipid rafts的主要成分,通過研究膽固醇可以錨定研究Lipidrafts的功能,Methyl-β-cyclodextrin(MβCD)能夠有效去除細胞膽固醇分子,可以用于Lipid rafts功能研究。本研究發(fā)現(xiàn)采用MβCD處理MDBK細胞可以有效的降低細胞膽固醇含量,同時能夠顯著抑制病毒的復制,且該抑制作

5、用具有劑量依賴性,MβCD處理的MDBK細胞經(jīng)外源水溶性膽固醇分子恢復處理后,可以部分回復病毒的復制功能,使病毒滴度增加,這表明細胞膽固醇分子的部分去除是造成該病毒滴度下降主要原因,進一步研究發(fā)現(xiàn)在病毒感染侵入后的階段去除膽固醇分子對病毒的滴度影響不顯著,膽固醇分子的去除并不影響病毒與MDBK細胞的結合。從病毒方面因素來考慮,采用MβCD處理病毒而降低囊膜膽固醇分子的含量也能導致病毒感染力下降,當補加外源性膽固醇分子時該抑制效應可以被部

6、分抵消,可見膽固醇分子對于病毒的感染力具有重要作用。綜上研究結果表明細胞膜膽固醇分子對于BoHV-1侵入靶細胞具有重要作用,而病毒囊膜膽固醇分子對于該病毒的感染力具有重要意義,這為深入研究該病毒致病機理打下基礎。由于Lipid rafts內(nèi)含有多種分子參與了細胞相關信號傳導,我們推測膽固醇分子的去除,破壞了一些信號分子發(fā)揮作用的環(huán)境,導致病毒侵入的某些環(huán)節(jié)被阻斷,鑒于目前BoHV-1感染的過程中激活了那些信號通路尚未見相關報道,所以該推

7、論需要研究證實。
　　 Phosphatidylinositol3-kinases/Akt(P13K/Akt),信號通路是執(zhí)行多種生物學功能的信號調(diào)控系統(tǒng),即在P13K的調(diào)節(jié)下Akt通過調(diào)節(jié)多種蛋白分子的活性來執(zhí)行P13K調(diào)控的多種生理學反應,如細胞存活和細胞增殖,血管生成,代謝調(diào)控和細胞遷移等。絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)超家族能夠將接受的多種刺激信號跨膜傳

8、遞到細胞核執(zhí)行相應的生物學功能,細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(Extracellular signal-regulated kinases1 and2,Erk1/2)作為MAPK超家族的成員參與調(diào)節(jié)多種細胞生物學功能如細胞增殖、細胞轉化、細胞分化、細胞存活和死亡等過程。BoHV-1感染MDBK細胞的過程中是否需要該P13K/Akt和MAPK/Erk1/2信號通路的參與尚不清楚。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)BoHV-1感染MDBK細胞的過程中能

9、夠激活Akt和Erk1/2,包括感染的早期短暫激活和晚期持續(xù)性激活,且經(jīng)紫外線滅活的病毒仍然能夠在感染的早期激活Akt和Erk1/2而不能在晚期激活Akt和Erk1/2,表明病毒與細胞結合和/或侵入的過程中能夠激活Akt和Erk1/2,后期Akt和Erk1/2的持續(xù)性激活與病毒基因表達的過程有關;病毒誘導的Akt激活可以被P13K抑制劑Ly294002特異性阻斷,病毒誘導的Erk1/2激活可以被MAPK激酶(MAPK kinase,ME

10、K1/2)的抑制劑U0126所抑制,這表明Akt和Erk1/2的上游激活子分別是P13K和MEK1/2。此外用Akt的抑制劑Ly294002處理MDBK細胞導致病毒滴度下降1.5log,表明P13K的激活對于病毒的復制具有重要意義,而MEK1/2的抑制劑處理細胞后病毒滴度無明顯變化,表明抑制MAPK/Erk1/2信號通路不影響病毒的復制;進一步研究發(fā)現(xiàn)P13K的激活對于該病毒的復制周期中侵入后階段影響顯著,盡管病毒與細胞結合即可激活該P

11、13K/Akt信號通路,但是抑制P13K的活性并不影響病毒與細胞的結合,同樣在侵入階段抑制P13K的活性對于該病毒的復制影響不顯著;本研究首次闡明在BoHV-1感染MDBK細胞的過程中能夠激活P13K/Akt和MAPK/Erk1/2兩個信號通路,特別是P13K的激活對于病毒復制周期的侵入后階段具有重要意義。
　　 Lipid rafts形成一個疏水性微環(huán)境,可能是多種分子相互作用的位點和場所,我們前期的研究發(fā)現(xiàn)膽固醇分子參與Bo

12、HV-1感染MDBK細胞的侵入過程,而在該病毒侵入和/或結合靶細胞的過程中又能激活P13K/Akt和MAPK/Erk1/2兩個信號通路,但是該信號通路的早期激活過程是否受膽固醇分子的影響并不清楚,本試驗發(fā)現(xiàn)降低細胞表面膽固醇含量對該病毒誘導的P13K/Akt和MAPK/Erk1/2早期激活影響不顯著。
　　 本研究首次闡明在BoHV-1感染MDBK細胞的過程中需要細胞膽固醇分子的參與才能有效的完成侵入過程,在感染的早期和晚期都能