多巴胺醌在帕金森病發(fā)病過程中的作用研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是年齡相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要特征是中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元特異性缺失。之前的研究表明多巴胺氧化在帕金森病發(fā)病過程中起重要作用。多巴胺在氧化過程中通過氧化還原反應(yīng)可產(chǎn)生多巴胺醌和活性氧，多巴胺醌能和含有半胱氨酸巰基的蛋白質(zhì)結(jié)合生成醌化蛋白，活性氧可能造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)探索了大鼠幼齡到老齡不同年齡段內(nèi)四個(gè)不同腦區(qū)醌化蛋白及脂質(zhì)氧化含量的表達(dá)變化。為了

2、進(jìn)一步確定醌化蛋白的生成與多巴胺能神經(jīng)元特異性缺失之間的關(guān)系，我們進(jìn)一步在細(xì)胞模型上檢測了神經(jīng)毒性藥物多巴胺、魚藤酮對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的毒性作用，分別檢測了細(xì)胞活性與醌化蛋白形成量及脂質(zhì)氧化水平之間的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了醌化蛋白的形成在帕金森病發(fā)病過程中對多巴胺能神經(jīng)元特異性缺失起著重要作用。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.NBT/Glycine法檢測醌化蛋白方法的確立及多巴胺自氧化檢測。
　　 運(yùn)用分光光度

3、計(jì)檢測法及蛋白印跡/NBT顯色法檢測了多巴胺自氧化及氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)/甘氨酸(Glycine)法檢測醌化蛋白的能力。結(jié)果顯示游離多巴胺具有自氧化現(xiàn)象，其氧化產(chǎn)物與蛋白具有特異性結(jié)合的能力。NBT/Glyeine法可以對多巴胺醌及醌化蛋白含量進(jìn)行檢測，該方法具有較高的穩(wěn)定性和特異性。
　　 2.大鼠老齡化過程中不同腦區(qū)醌化蛋白及脂質(zhì)氧化含量的變化研究。
　　 分離幼齡到

4、老齡(2-，6-，10-，15-月齡)不同年齡段四個(gè)不同腦區(qū)(前額葉皮層，海馬，尾狀核，黑質(zhì))腦組織樣品，運(yùn)用分光光度計(jì)及蛋白印跡/NBT顯色法分別檢測了每組樣品中醌化蛋白含量隨年齡增長的變化，通過丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量變化的檢測，研究了不同樣品中脂質(zhì)氧化情況隨年齡增長的變化，運(yùn)用雙向電泳(Two Dimensional electrophoresis，2-DE)技術(shù)及蛋白印跡/NBT顯色法分離出易于被多巴

5、胺醌修飾的靶蛋白。結(jié)果顯示海馬腦區(qū)沒有檢測到醌化蛋白含量隨年齡增長而顯著性增加，前額葉皮層和紋狀體內(nèi)醌化蛋白含量隨年齡增長有微小但顯著的差異，而黑質(zhì)區(qū)醌化蛋白含量增加最為顯著，和2-月齡組比較，黑質(zhì)腦區(qū)醌化蛋白含量在15-月齡組增加了約50％，同時(shí)雙向電泳及蛋白印跡/NBT顯色法檢測出15-月齡黑質(zhì)區(qū)含有更多的醌化蛋白點(diǎn)。腦組織樣品四個(gè)腦區(qū)均未檢測到脂質(zhì)氧化水平隨年齡增長而有顯著性差異。以上結(jié)果表明，黑質(zhì)區(qū)醌化蛋白的含量變化具有顯著的年

6、齡相關(guān)性，醌化蛋白的形成可能對帕金森病發(fā)病過程中多巴胺能神經(jīng)元選擇性缺失起著至關(guān)重要作用。
　　 3.多巴胺、魚藤酮對細(xì)胞毒性作用的研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證醌化蛋白的形成與多巴胺引起的細(xì)胞毒性之間的相關(guān)性，我們進(jìn)行了多巴胺對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的毒性實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium-bromide，MTT)比色法和活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測不同藥

7、物多巴胺、魚藤酮對SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響，運(yùn)用MTT比色法檢測二相酶誘導(dǎo)劑蘿卜硫素(Sulforaphane，SF)對多巴胺誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，通過NBT/Glyeine法及MDA檢測法探索多巴胺、魚藤酮抑制細(xì)胞活性的作用機(jī)制。結(jié)果顯示多巴胺作用SH-SY5Y細(xì)胞24h可導(dǎo)致細(xì)胞活性顯著性降低，并具有多巴胺濃度依賴性，同時(shí)上清和沉淀樣品醌化蛋白含量隨多巴胺濃度的增加而增多，且沉淀部分中醌化蛋白的含量增長最為顯著。1μmol/

8、LSF預(yù)作用細(xì)胞24h可顯著抑制多巴胺誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞存活率上升，同時(shí)細(xì)胞上清和沉淀樣品中醌化蛋白含量降低。MDA檢測結(jié)果顯示在多巴胺濃度0～400μmol/L的范圍內(nèi)未檢測到脂質(zhì)氧化水平的顯著性變化。
　　 魚藤酮濃度在1000 nmol/L時(shí)細(xì)胞活性出現(xiàn)顯著性降低，同時(shí)上清樣品醌化蛋白含量隨魚藤酮濃度的增加而減少，沉淀樣品中醌化蛋白含量隨魚藤酮濃度的增加而增多。MDA檢測在魚藤酮濃度0～1000 nmo