過表達(dá)miR-145治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-145進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并驗(yàn)證，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察miR-145對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠Th17細(xì)胞分化及其介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的影響，以揭示miR-145在EAMG發(fā)病機(jī)制中的作用，為MG的治療開辟新途徑。
　　方法：1.用TargetScan靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-145的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并進(jìn)行熒光素酶活性分析進(jìn)一步驗(yàn)證。2.體外實(shí)驗(yàn):采用CFA+R97-116肽段免疫Lewis大鼠，第14天處

2、死大鼠，取脾分離單核細(xì)胞，并進(jìn)一步經(jīng)免疫磁珠(MACS)分選CD4+T細(xì)胞，將細(xì)胞分為空白組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染pre-miR-145及pre-miR-control，于轉(zhuǎn)染后第48h收集一部分細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率，Q-PCR分析miR-145表達(dá)，Westren Blot檢測(cè)NFATc1蛋白表達(dá)。將另一部分轉(zhuǎn)染后的CD4+T細(xì)胞繼續(xù)與純化的DC細(xì)胞以3∶1比例共培養(yǎng)，于共培養(yǎng)的第96h經(jīng)ELISA檢測(cè)IL-17濃度，流

3、式檢測(cè)CD4+IL-17+細(xì)胞表達(dá)。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):構(gòu)建miR-145慢病毒載體，進(jìn)行miR-145慢病毒包裝及其滴度測(cè)定。構(gòu)建EAMG模型，隨機(jī)相匹配地分為CFA組（即空白組）和EAMG模型組（實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組）。依照Lennon評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，利用雙盲法對(duì)兩組鼠每天進(jìn)行體重測(cè)量和行為學(xué)觀察。在第二次免疫當(dāng)天，實(shí)驗(yàn)組將Lenti-miRNA-145經(jīng)尾靜脈注射給大鼠，對(duì)照組給予Lenti-miRNA-control，隔日繼續(xù)進(jìn)行評(píng)估，繪制體重及

4、評(píng)分變化曲線。一部分于病毒注射30天后Q-PCR檢測(cè)各個(gè)免疫器官（包括脾臟、外周淋巴結(jié)、胸腺）中miR-145的表達(dá)。另一部分大鼠分別于第二次免疫后第14、28、36天通過ELISA檢測(cè)大鼠外周血抗AChR IgG表達(dá)。于病毒注射后第36天處死大鼠取脾，其中一部分脾細(xì)胞提蛋白經(jīng)Western Blot檢測(cè)NFATc1蛋白表達(dá)，另一部分經(jīng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+IL-17+T細(xì)胞表達(dá)。
　　本研究測(cè)定值

5、用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。成組設(shè)計(jì)的多樣本均數(shù)間的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組之間兩兩比較用最小顯著差數(shù)法(leastsignificant difference，LSD);兩樣本均數(shù)間的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所以數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：1.生物信息學(xué)分析結(jié)果:NFATc1是miR-145的一個(gè)新的與免疫相關(guān)的靶基因。熒光素酶

6、檢測(cè)結(jié)果:與miR-control和pisCHECK2-NFATc1共轉(zhuǎn)染組相比，miR-145和pisCHECK2-NFATc1共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著減低;pisCHECK2-NFATc1突變體為4個(gè)連續(xù)堿基突變而來，miR-control和pisCHECK2-NFATc1突變體共轉(zhuǎn)染組與miR-145和pisCHECK2-NFATc1突變體共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無差異。2.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Q-PCR結(jié)果顯示miR-145在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)

7、顯著升高，Western Blot結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組NFATc1的表達(dá)顯著下降;DC-T共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示pre-miR-145轉(zhuǎn)染組IL-17水平下降，流式檢測(cè)結(jié)果顯示pre-miR-145轉(zhuǎn)染組CD4+IL-17+T細(xì)胞比例顯著降低。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:測(cè)序結(jié)果證明慢病毒載體構(gòu)建及包裝成功。Q-PCR結(jié)果顯示miR-145在實(shí)驗(yàn)組中脾臟及淋巴結(jié)中表達(dá)顯著升高，在胸腺中表達(dá)升高不明顯。體內(nèi)注射慢病毒36天時(shí)Western

8、Blot結(jié)果顯示NFATc1在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)顯著下降(P＜0.01)，ELISA結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組IL-17的表達(dá)顯著降低，流式檢測(cè)結(jié)果亦顯示實(shí)驗(yàn)組CD4+IL-17+T細(xì)胞比例顯著下降(P＜0.01)。臨床評(píng)分及體重曲線均顯示實(shí)驗(yàn)組EAMG大鼠肌無力癥狀改善。 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示第28天、36天時(shí)實(shí)驗(yàn)組抗AChR IgG的分泌下降。
　　結(jié)論：通過靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)并經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)NFATc1為miR-145的一個(gè)新的與