過表達miR-145治療實驗性自身免疫性重癥肌無力的實驗研究.pdf

1、目的：本實驗對miR-145進行靶基因預(yù)測并驗證，通過體內(nèi)外實驗觀察miR-145對實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠Th17細胞分化及其介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的影響，以揭示miR-145在EAMG發(fā)病機制中的作用，為MG的治療開辟新途徑。
　　方法：1.用TargetScan靶基因預(yù)測軟件對miR-145的靶基因進行預(yù)測并進行熒光素酶活性分析進一步驗證。2.體外實驗:采用CFA+R97-116肽段免疫Lewis大鼠，第14天處

2、死大鼠，取脾分離單核細胞，并進一步經(jīng)免疫磁珠(MACS)分選CD4+T細胞，將細胞分為空白組、實驗組和對照組，實驗組與對照組分別轉(zhuǎn)染pre-miR-145及pre-miR-control，于轉(zhuǎn)染后第48h收集一部分細胞分析轉(zhuǎn)染效率，Q-PCR分析miR-145表達，Westren Blot檢測NFATc1蛋白表達。將另一部分轉(zhuǎn)染后的CD4+T細胞繼續(xù)與純化的DC細胞以3∶1比例共培養(yǎng)，于共培養(yǎng)的第96h經(jīng)ELISA檢測IL-17濃度，流

3、式檢測CD4+IL-17+細胞表達。3.體內(nèi)實驗:構(gòu)建miR-145慢病毒載體，進行miR-145慢病毒包裝及其滴度測定。構(gòu)建EAMG模型，隨機相匹配地分為CFA組（即空白組）和EAMG模型組（實驗組，對照組）。依照Lennon評分標準，利用雙盲法對兩組鼠每天進行體重測量和行為學(xué)觀察。在第二次免疫當天，實驗組將Lenti-miRNA-145經(jīng)尾靜脈注射給大鼠，對照組給予Lenti-miRNA-control，隔日繼續(xù)進行評估，繪制體重及

4、評分變化曲線。一部分于病毒注射30天后Q-PCR檢測各個免疫器官（包括脾臟、外周淋巴結(jié)、胸腺）中miR-145的表達。另一部分大鼠分別于第二次免疫后第14、28、36天通過ELISA檢測大鼠外周血抗AChR IgG表達。于病毒注射后第36天處死大鼠取脾，其中一部分脾細胞提蛋白經(jīng)Western Blot檢測NFATc1蛋白表達，另一部分經(jīng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后收集細胞經(jīng)流式細胞儀檢測CD4+IL-17+T細胞表達。
　　本研究測定值

5、用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。成組設(shè)計的多樣本均數(shù)間的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組之間兩兩比較用最小顯著差數(shù)法(leastsignificant difference，LSD);兩樣本均數(shù)間的比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對所以數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：1.生物信息學(xué)分析結(jié)果:NFATc1是miR-145的一個新的與免疫相關(guān)的靶基因。熒光素酶

6、檢測結(jié)果:與miR-control和pisCHECK2-NFATc1共轉(zhuǎn)染組相比，miR-145和pisCHECK2-NFATc1共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著減低;pisCHECK2-NFATc1突變體為4個連續(xù)堿基突變而來，miR-control和pisCHECK2-NFATc1突變體共轉(zhuǎn)染組與miR-145和pisCHECK2-NFATc1突變體共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無差異。2.體外實驗結(jié)果:Q-PCR結(jié)果顯示miR-145在實驗組中表達

7、顯著升高，Western Blot結(jié)果顯示實驗組NFATc1的表達顯著下降;DC-T共培養(yǎng)實驗中，ELISA檢測結(jié)果顯示pre-miR-145轉(zhuǎn)染組IL-17水平下降，流式檢測結(jié)果顯示pre-miR-145轉(zhuǎn)染組CD4+IL-17+T細胞比例顯著降低。3.體內(nèi)實驗結(jié)果:測序結(jié)果證明慢病毒載體構(gòu)建及包裝成功。Q-PCR結(jié)果顯示miR-145在實驗組中脾臟及淋巴結(jié)中表達顯著升高，在胸腺中表達升高不明顯。體內(nèi)注射慢病毒36天時Western

8、Blot結(jié)果顯示NFATc1在實驗組表達顯著下降(P＜0.01)，ELISA結(jié)果顯示實驗組IL-17的表達顯著降低，流式檢測結(jié)果亦顯示實驗組CD4+IL-17+T細胞比例顯著下降(P＜0.01)。臨床評分及體重曲線均顯示實驗組EAMG大鼠肌無力癥狀改善。 ELISA檢測結(jié)果顯示第28天、36天時實驗組抗AChR IgG的分泌下降。
　　結(jié)論：通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測并經(jīng)熒光素酶報告基因檢測證實NFATc1為miR-145的一個新的與