實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力大鼠外周血淋巴細(xì)胞microRNA表達(dá)譜研究.pdf

1、目的：探討微小RNA(microRNA)在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠外周血淋巴細(xì)胞中的特異性表達(dá)，并進(jìn)一步作microRNA靶基因預(yù)測。
　　方法：1.12只雌性Lewis大鼠，SPF級，6-8周，體重150-180g，隨機(jī)分組為EAMG組8只和對照組4只。EAMG模型的建立：首先制備抗原乳劑，具體流程如下：以生理鹽水(normal sodium，NS)溶解大鼠AchR97-116肽段，再與卡介苗(結(jié)核分枝桿菌菌株

2、H37Ra)及完全弗氏佐劑(CFA)充分混勻成乳劑(其中AchR97-116肽段濃度為50μg/200μl，卡介苗濃度為1mg/ml。免疫部位：雙后肢足掌皮下。對照組：只接受等量完全弗氏佐劑(CFA)與生理鹽水(NS)混合乳劑，于雙后肢足掌皮下免疫。免疫部位：雙后肢足掌皮下。對照組：只接受等量完全弗氏佐劑(CFA)與生理鹽水(NS)混合乳劑，于雙后肢足掌皮下免疫。依照Lennon評分標(biāo)準(zhǔn)[1]，利用雙盲法對兩組鼠每天進(jìn)行體重測量和行為學(xué)

3、觀察。2.當(dāng)EAMG組大鼠臨床評分達(dá)到2分時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，分別對EAMG組和對照組大鼠進(jìn)行頸動(dòng)脈采血，密度梯度離心法(Ficoll法)分離外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)。采用microRNA基因芯片和定量PCR技術(shù)分析并驗(yàn)證EAMG大鼠PBMCs的microRNA表達(dá)譜。3.構(gòu)建第二批EAMG組和對照組模型后，分離出PBMCs，并進(jìn)一步經(jīng)MACS負(fù)性分選CD4+T細(xì)胞，

4、流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞分選純度(當(dāng)CD4+T細(xì)胞分選純度>90％時(shí)，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn))。根據(jù)芯片分析結(jié)果，選取興趣microRNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，Q-PCR)技術(shù)分析CD4+T細(xì)胞興趣microRNA表達(dá)。4.運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測興趣microRNA的靶基因并用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　結(jié)果：1.EAMG模型組大鼠免疫后出現(xiàn)兩個(gè)發(fā)病時(shí)相，分別開始于免疫后第1天、第

5、28天左右，并分別于第7天和第56天達(dá)到發(fā)病高峰，且僅極少數(shù)發(fā)生死亡。早期發(fā)病時(shí)相疾病嚴(yán)重程度較輕微，低于1分(Lennon評分標(biāo)準(zhǔn))，屬于一過性發(fā)病且維持時(shí)間短暫，在此期間伴隨著體重的輕度下降；晚期發(fā)病時(shí)相開始于第1次免疫后49天，并逐漸加重，表現(xiàn)為消瘦、震顫、活動(dòng)無力、撕咬無力、弓背低頭垂尾姿勢、甚至全身衰竭等。CFA大鼠免疫則未出現(xiàn)明顯的上述癥狀。發(fā)病第7天EAMG組(159.0±2.5)g，對照組為(158.8±3.8)g(P>

6、0.05)，兩組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。發(fā)病第56天EAMG組(150.0±4.5)g，對照組為(210.8±4.4)g，兩組大鼠體重比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.microRNA基因芯片結(jié)果顯示：11個(gè)microRNAs在EAMG組中表達(dá)差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；P<0.01)：8個(gè)miRNAs(miR-24、miR-151、miR-423、miR-181c、miR-145、miR-326

7、、miR-143和miR-328a)表達(dá)下調(diào)，3個(gè)miRNAs(miR-101a、miR-193和miR-33)表達(dá)上調(diào)。3.Q-PCR檢測EAMG組和對照組大鼠淋外周血巴細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞miR-145表達(dá)，結(jié)果顯示miR-145在EAMG大鼠外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而在CD4+T細(xì)胞則顯著降低(P<0.01)。4.生物信息學(xué)分析顯示并經(jīng)熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)：T細(xì)胞激活所需的重要共刺激分子CD28是miR-145的下