雞鈣代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因的克隆重組與表達(dá)研究.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文雞鈣代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因的克隆重組與表達(dá)研究姓名：章世元申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖指導(dǎo)教師：楊利國20050601博士論文：雞鈣代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因的克隆重組與表達(dá)研究素氧基酸序列與鰻魚最接近，達(dá)到969％，其次是鮭魚，達(dá)937％。新?lián)P州雞甲狀旁腺激素的氨基酸序列與哺乳動(dòng)物甲狀旁腺激素的氨基酸序列差異較大，與牛、人、鼠和豬甲狀旁腺激素的簧基酸序列的同源性分別為425％、354％、386％弄口449％。不同

2、動(dòng)物種屬間D28k鈣結(jié)合蛋白的氨基酸序列的同源性均較高，新?lián)P州雞與蟾蜍的氨基酸序列較接近，同源性達(dá)到793％。2鈣代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)需要先后用本研究擴(kuò)增得到的三個(gè)鈣代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因分別與pcDNA3和pCEP4等真核表達(dá)載體連接，進(jìn)行了擴(kuò)增基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的研究。①對栽體和目的基因均采用BarnHI和HindlIJ對雞降鈣素基因與pcDNA3和pCEP4載體分別進(jìn)行雙酶切、連接，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。⑦采用EcoRI

3、和BamHI對雞甲狀旁腺激素基因和peDNA3載體進(jìn)行酶切和重組。在使用pCEP4載體時(shí)，對目的基因選擇EcoRI和BamHI兩種內(nèi)切酶，而對載體則選擇了PvuⅡ內(nèi)切酶，并對其切出的線性化目的基因片段再用Klenow酶補(bǔ)成平端，經(jīng)過如此處理后有利于提高真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的效率。③用XhoI和BamHI對pCEP4載體和雞D28k鈣結(jié)合蛋白基因進(jìn)行酶切，并構(gòu)建重組質(zhì)粒。④對上述構(gòu)建的五個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過相應(yīng)的酶切鑒定和PCR擴(kuò)增均證明目的基

4、因已正確插入到表達(dá)載體中。3重組鈣代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)及其對鈣代謝的調(diào)節(jié)為了檢驗(yàn)本研究構(gòu)建的五個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)效力以及對蛋雞體內(nèi)部分與鈣磷代謝有關(guān)的主要生化指標(biāo)的影響，將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒與聚乙烯亞胺(PEI)混勻處理后，通過熒光檢測進(jìn)行了重組pCEP4CaBP—D28k質(zhì)粒導(dǎo)入COS一1細(xì)胞表達(dá)效果的評價(jià)。先后分三批次進(jìn)行了重組基因真核表迭質(zhì)粒在新?lián)P州保種雞體內(nèi)表達(dá)效果的研究。試驗(yàn)雞為450日齡、體重18O43kg，

5、每次均設(shè)對照組，注射相同拷貝數(shù)的真核表達(dá)載體。試驗(yàn)組數(shù)隨每次注射質(zhì)粒數(shù)而定，各組雞的數(shù)量均為10只。采集血樣及注射按試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理方案進(jìn)行，分離得到血清后測定其中的降鈣素、甲狀旁腺激素、雌二醇、鈣和磷的濃度。D28k鈣結(jié)合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PEI處理后轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞。熒光檢測表明，本重組質(zhì)?？稍贑OS一1細(xì)胞高效表達(dá)。新?lián)P州雞注射兩種重組降鈣素質(zhì)粒后2、4乖6周，血清中降鈣素的平均值均顯著地高于對照組(P001)。注射兩個(gè)質(zhì)粒后2、4、