RERT-lncRNA中插入缺失多態(tài)與肝細胞肝癌易感性關(guān)聯(lián)研究及功能分析.pdf

1、目的：研究RAB4B-EGLN2通讀長鏈非編碼RNA中的一個功能性插入/缺失多態(tài)（rs10680577）與中國人群肝細胞肝癌（HCC）易感性的關(guān)聯(lián)，并利用基因型-表型關(guān)聯(lián)研究及分子生物學方法探討該多態(tài)參與肝細胞肝癌發(fā)生的功能及意義。
　　方法：（1）運用生物信息學工具查找出RAB4B-EGLN2通讀中的多態(tài)，并從中選取一個具有潛在功能的四堿基插入/缺失(Indel)多態(tài)基因座（rs10680577）作為候選多態(tài)；（2）采用病例對照

2、研究方法（1067HCC病例和1692正常對照），PCR擴增結(jié)合非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對候選多態(tài)進行基因分型，Logistic回歸統(tǒng)計分析基因多態(tài)基因座與HCC的關(guān)聯(lián)性；（3）運用Realtime PCR和Western blot研究肝細胞肝癌組織和五種肝細胞株（HepG2,Hep3B,SMMC7721,SK-Hep-1,L02）中rs10680577多態(tài)與EGLN2表達量的基因型-表型關(guān)聯(lián)；（4）構(gòu)建EGLN2啟動子報告質(zhì)粒導入

3、五種肝細胞株做雙熒光素酶報告基因測試的方法檢測其是否通過影響啟動子而發(fā)生調(diào)節(jié)作用；（5）考慮到基因座所處位置，利用生物信息學的方法預測rs10680577多態(tài)基因座對RAB4B-EGLN2通讀長鏈非編碼RNA（RAB4B-EGLN2 readthrough long non coding RNA, RERT-lncRNA）折疊二級結(jié)構(gòu)的影響;（6）構(gòu)建RERT-lncRNA-pcDNA3.1(+)真核表達載體并瞬轉(zhuǎn)入三種肝癌細胞株（He

4、pG2, SMMC-7721和sk-Hep-1）檢測RERT-lncRNA和EGLN2 mRNA的方法進行功能性驗證。
　　結(jié)果：（1）基因分型結(jié)果顯示，位于RAB4B-EGLN2通讀內(nèi)的rs10680577基因座具有較好的多態(tài)性，病例組中rs10680577基因座4-bp插入(Ins)和4-bp缺失(Del)的等位基因頻率分別為0.759,0.241;正常組則分別為0.819,0.181。病例組和對照組中rs10680577基因

5、座的等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。調(diào)整性別、年齡、吸煙、飲酒、HBV感染等主要風險因素后，運用Logistic回歸分析的方法對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結(jié)果顯示：與4-bpIns/Ins純合子相比，4-bpDel/Del純合子個體HCC易感性明顯增高（OR=2.32，95% C.I.:1.54-3.49, P<0.0001）；等位基因水平分析顯示，與Ins等位基因相比，攜帶Del等位基因的個體患

6、HCC的風險亦明顯增高（OR=1.44，95%C.I.:1.26-1.64，P<0.001）。吸煙狀態(tài)的分層分析發(fā)現(xiàn)，這種陽性關(guān)聯(lián)在重度吸煙人群中更顯著（Heterogeneity P=0.0002）；（2）rs10680577基因座與EGLN2的基因型-表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示， Del/Del和Ins/Del基因型組肝癌組織中EGLN2 mRNA的表達較Ins/Ins基因型組明顯增高，而鄰近的RAB4B mRNA則無明顯變化。在四種肝癌

7、細胞株和一種肝細胞株中，攜帶Del/Del基因型的Hep3B細胞株中EGLN2 mRNA的表達也比攜帶Ins/Ins基因型的HepG2，sk-Hep-1，SMMC-7721和L02四種細胞株明顯增高。Western blot結(jié)果顯示攜帶Del/Del基因型的肝癌細胞和組織EGLN2蛋白均比攜帶Ins/Del和Ins/Ins基因型的細胞和組織增高;（3）構(gòu)建包含rs10680577插入和缺失等位基因的EGLN2啟動子的兩種質(zhì)粒，雙熒光素酶

8、報告基因測試結(jié)果顯示，導入五種細胞株中的兩種質(zhì)粒表達無明顯統(tǒng)計學差別;（4）生物信息學預測結(jié)果提示，rs10680577多態(tài)可使RAB4B-EGLN2通讀長鏈非編碼RNA的空間構(gòu)象存在差別。肝癌細胞和組織中EGLN2和RERT-lncRNA的表達呈強相關(guān)(分別為R2=0.823, P=0.034與 R2=0.540, P<0.001)，而且攜帶缺失等位基因RERT-lncRNA的表達比不攜帶缺失等位基因顯著增高;（5）構(gòu)建包含rs106

9、80577插入等位基因的RERT-lncRNA pcDNA3.1(+)表達質(zhì)粒和空質(zhì)粒并導入HepG2，SMMC-7721和sk-Hep-1三種細胞株，RERT-lncRNA升高4.73-9.82倍，EGLN2升高1.61-1.75倍。
　　結(jié)論：（1）中國人群中rs10680577多態(tài)與肝細胞肝癌易感性存在顯著關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)在重度吸煙患者中更為明顯；（2）肝癌組織中EGLN2的表達量與rs10680577多態(tài)之間存在顯著的基因型