一氧化氮生物利用率在儲存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【背景】臨床上儲存紅細(xì)胞（RBC）輸入常用于治療貧血或急性失血（如失血性休克），通過增加體內(nèi)血紅蛋白（Hb）含量維持組織和器官氧供。每年全世界收集約8000萬單位RBC，在美國每年約有1500萬單位RBC用于臨床治療，回輸前RBC的平均儲存時(shí)間約為17天。RBC在體外儲存過程中發(fā)生一系列生理生化、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能變化，稱為“儲存損傷”。此外，RBC回輸是一項(xiàng)經(jīng)驗(yàn)性的治療，在用于臨床之前沒有經(jīng)過嚴(yán)格的前瞻性隨機(jī)對照研究。越來越多的證據(jù)顯示儲

2、存RBC輸入可能與感染、死亡率增加、多器官功能衰竭、住院時(shí)間延長等不良反應(yīng)相關(guān)。
　　儲存RBC輸入后發(fā)生不良反應(yīng)的確切機(jī)制尚不明確。RBC體外儲存過程中隨著儲存時(shí)間延長溶血率增加，而且約有25％RBC在回輸后24小時(shí)內(nèi)被破壞造成血管內(nèi)溶血。研究表明游離Hb與一氧化氮（NO）發(fā)生加氧反應(yīng)的速度較RBC內(nèi)的Hb大大增加，很少量的游離Hb就能極大的降低血管內(nèi)皮中NO的生物利用率。NO是人體生理功能發(fā)揮的重要信號分子。NO具有調(diào)節(jié)血流、

3、擴(kuò)張血管、增加血管反應(yīng)性、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抑制血小板活化、調(diào)節(jié)血管通透性、介導(dǎo)免疫反應(yīng)、參與神經(jīng)傳遞的重要作用。NO生物利用率下降將導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、粘附分子表達(dá)、血小板和凝血因子活化及氧自由基（ROS）產(chǎn)生等不良反應(yīng)。RBC能夠通過細(xì)胞內(nèi)的NO合酶（NOS）和去氧Hb的亞硝酸還原作用生成NO。RBC體外儲存之后，NO的生成減少。因此我們推測儲存RBC回輸?shù)牟涣挤磻?yīng)可能與NO生成減少、破壞增多導(dǎo)致血管內(nèi)NO生物利用率降低有關(guān)。

4、>　　內(nèi)皮功能障礙是指由于血管內(nèi)NO含量降低，給予乙酰膽堿后內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張反應(yīng)降低。通常內(nèi)皮功能障礙與糖尿病和高脂血癥有關(guān)。在db/db小鼠和喂飼高脂飲食的WT小鼠（HFD小鼠）中有明顯的內(nèi)皮功能障礙。本研究通過建立小鼠RBC儲存和輸入模型，將儲存RBC輸入健康和內(nèi)皮功能障礙小鼠中，研究NO生物利用率降低在儲存RBC回輸不良反應(yīng)中的影響及其作用機(jī)制，同時(shí)觀察通過補(bǔ)充外源性的NO對儲存RBC回輸不良反應(yīng)的預(yù)防和治療作用。
　　實(shí)

5、驗(yàn)一小鼠RBC儲存損傷研究
　　【目的】研究小鼠RBC體外儲存后儲存損傷程度，建立合適的小鼠RBC儲存系統(tǒng)。
　　【方法】將C57BL/6小鼠麻醉后開胸心臟取血。每次約抽取25只小鼠全血進(jìn)行混合，加入14％CPDA-1作為抗凝劑和儲存液。濾除全血中的白細(xì)胞（WBC）后，離心將剩余血液濃縮至血球壓積（Hct）為70-75％，分裝至無菌的離心管中4°C保存。將RBC分成兩組：新鮮RBC組（儲存時(shí)間<24小時(shí)，F(xiàn)RBC）和儲存RB

6、C組（儲存時(shí)間為2周，SRBC）。比較兩組RBC的生理生化指標(biāo)差異，觀察儲存后RBC形態(tài)和功能的變化。
　　【結(jié)果】1.生化指標(biāo)變化：與FRBC相比，SRBC中pH、PO2、HCO3-顯著下降；PCO2、SBE、BUN和乳酸水平明顯上升，說明RBC經(jīng)體外儲存后發(fā)生代謝性酸中毒；細(xì)胞外Na＋顯著降低，同時(shí)K＋水平顯著上升，提示隨著儲存時(shí)間延長，RBC細(xì)胞膜上Na-K-ATP酶活性喪失。SRBC溶血率是FRBC溶血率的8倍。與FRBC

7、相比SRBC上清液中游離Hb和metHb的含量明顯升高。2.形態(tài)學(xué)改變：將FRBC和SRBC涂片后染色發(fā)現(xiàn)FRBC中大多數(shù)RBC為正常雙凹圓盤狀結(jié)構(gòu)。RBC儲存兩周后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，大多數(shù)為形態(tài)異常的棘紅細(xì)胞、棘球狀紅細(xì)胞、裂口紅細(xì)胞和球形紅細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)的改變提示有細(xì)胞膜喪失，細(xì)胞變形能力降低。3.功能變化：與FRBC相比，SRBC細(xì)胞內(nèi)ATP和2,3-DPG含量明顯降低，Hb氧離曲線（ODC）左移，P50顯著降低，提示RBC對氧的

8、的親和力增加，不利于外周器官氧的釋放。分別將FRBC和SRBC回輸檢測RBC回輸后的恢復(fù)率，結(jié)果表明部分SRBC在回輸后24小時(shí)內(nèi)被迅速清除，RBC生存曲線斜率與FRBC相比有顯著差異（P<0.0001）。從24小時(shí)至第8天，F(xiàn)RBC與SRBC的下降的速率沒有顯著差異?；剌?4小時(shí)后，F(xiàn)RBC的恢復(fù)率為99％；SRBC的恢復(fù)率為68％，與FRBC相比31％的SRBC輸入后24小時(shí)被破壞清除，將增加血管內(nèi)溶血和游離Hb含量。與FRBC相比

9、，SRBC上清液中的TXB2含量顯著增加，表明SRBC上清液具有促凝作用。
　　【結(jié)論】小鼠SRBC體外儲存2周后發(fā)生顯著的生理生化、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能改變。表現(xiàn)為pH下降發(fā)生代謝性酸中毒、細(xì)胞內(nèi)外的離子分布失衡、ATP含量下降，伴隨RBC細(xì)胞膜喪失，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，RBC變形能力降低。2,3-DPG降低，RBC與氧親和力增加，RBC回輸后生存率降低，SRBC上清液中存在大量游離Hb。將各項(xiàng)指標(biāo)與人儲存RBC比較，儲存2周小鼠RBC

10、與儲存6周人RBC儲存損傷程度相似。
　　實(shí)驗(yàn)二NO生物利用率對儲存RBC回輸?shù)挠绊懠皺C(jī)制研究
　　【目的】研究儲存RBC回輸對健康和內(nèi)皮功能障礙HFD和db/db小鼠的影響，探討NO生物利用率在其中的作用和機(jī)制。
　　【方法】將36只野生型C57BL/6(WT)小鼠平均分成3組（n=12)：對照組（control）不接受任何輸血或輸液；新鮮RBC輸入組（FRBC）經(jīng)尾靜脈注射占全身血容量10％(相當(dāng)于臨床一個(gè)單位RB

11、C輸入)，儲存時(shí)間小于24小時(shí)的新鮮RBC；儲存RBC輸入組（SRBC）經(jīng)尾靜脈輸入占全身血容量10％，儲存時(shí)間為2周的儲存RBC。將24只喂飼4-6周高脂飲食的(HFD)小鼠（n=12）平均分為3組，其分組方式與WT小鼠相同。將90只遺傳背景為C57BL/6的自發(fā)糖尿病(db/db)小鼠隨機(jī)分成9組：對照組、FRBC組、SRBC組處理方式與WT以及HFD小鼠相同；SRBC＋iNO組在輸入SRBC之前10分鐘開始吸入80百萬分率（par

12、tspermillion,ppm）NO，并維持2小時(shí)；FRBC和SRBC上清液輸入組經(jīng)尾靜脈分別輸入FRBC或SRBC離心后的上清液；洗滌FRBC和洗滌SRBC組經(jīng)尾靜脈分別輸入洗滌FRBC或SRBC；SRBC上清液氧化組經(jīng)尾靜脈輸入氧化的SRBC上清液。一部分WT和db/db小鼠在經(jīng)過尾靜脈注射后10分鐘處死，取血測量各種生化指標(biāo)。其余動物注射后無創(chuàng)監(jiān)測血壓2小時(shí)后處死，取血液測量各項(xiàng)生化指標(biāo)后離心，將獲得的血漿儲存。同時(shí)儲存動物的器

13、官留作分析。
　　【結(jié)果】由于直接輸入了Hct為70-75％的濃縮RBC，因此將FRBC和SRBC輸入WT、HFD和db/db小鼠均導(dǎo)致Hct和總Hb含量較對照組增加。與對照組相比血漿游離Hb含量FRBC和SRBC輸入組均顯著增加。各SRBC輸入組血漿游離Hb與FRBC組相比顯著增加。將SRBC輸入WT小鼠10分鐘后后血乳酸水平顯著增加，說明存在代謝性酸中毒。除此之外，其它生化和血液指標(biāo)在各組間無顯著差異，說明小鼠能耐受小劑量SR

14、BC直接輸入而不發(fā)生明顯的生化改變。輸入FRBC或SRBC對WT和HFD小鼠收縮壓（SBP）沒有明顯影響。與輸入FRBC相比，將SRBC輸入db/db小鼠后SBP顯著升高。吸入80ppmNO將SRBC輸入引起的高血壓反應(yīng)完全逆轉(zhuǎn)，說明將SRBC輸入db/db小鼠引起的高血壓反應(yīng)可能與NO生物利用率降低有關(guān)。為了進(jìn)一步研究究竟是儲存RBC什么成分誘導(dǎo)db/db小鼠發(fā)生高血壓反應(yīng)，將SRBC上清液輸入db/db小鼠之后，SBP明顯升高。而將

15、洗滌FRBC或者洗滌SRBC輸入db/db小鼠后不發(fā)生高血壓反應(yīng)。說明是SRBC上清液中某種成分導(dǎo)致高血壓反應(yīng)。此外，將SRBC上清液中游離Hb氧化成高鐵Hb（metHb）之后輸入，完全消除了SRBC上清液輸入引起的高血壓反應(yīng)。因?yàn)閙etHb不與NO發(fā)生加氧反應(yīng)，說明輸入SRBC后上清液中的游離Hb通過清除NO，降低NO生物利用率導(dǎo)致db/db小鼠高血壓反應(yīng)。與對照組和FRBC組相比，各組動物輸入SRBC2小時(shí)后血清中鐵含量顯著升高。而

16、肝臟中非血紅素結(jié)合鐵含量各組之間沒有顯著差異。與對照組和FRBC組相比，輸入SRBC2小時(shí)后，血漿IL-6水平和肝臟中IL-6mRNA表達(dá)明顯升高，全身炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。與對照組和FRBC組相比，輸入SRBC2小時(shí)后，肝臟中HO-1mRNAh和hepcidin表達(dá)水平在WT、HFD和db/db小鼠中均顯著升高。
　　【結(jié)論】將儲存RBC輸入后在WT、HFD和db/db小鼠中引起顯著的炎癥反應(yīng)和鐵超載等不良發(fā)應(yīng)；SRBC輸入db/db小

17、鼠后引起血管收縮反應(yīng)是由于NO被SRBC上清液中的游離Hb清除、血管內(nèi)NO生物利用率下降所致，補(bǔ)充外源性的NO能消除SRBC輸入引起的高血壓反應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)三NO生物利用率對儲存RBC復(fù)蘇失血性休克小鼠的影響及其機(jī)制研究
　　【目的】研究用儲存RBC對失血性休克小鼠進(jìn)行復(fù)蘇的效果，探索NO生物利用率降低對大量輸入儲存RBC的影響和機(jī)制。
　　【方法】將60只WT小鼠隨機(jī)分成3組（n=20）:對照組（Control）與其

18、它組動物接受相同的手術(shù)操作但不發(fā)生失血性休克；FRBC組動物抽血制作失血性休克模型，90分鐘后用FRBC進(jìn)行復(fù)蘇；SRBC組動物失血性休克90分鐘之后用SRBC進(jìn)行復(fù)蘇。將80只HFD小鼠隨機(jī)分成4組（n=20）:對照組、FRBC組和SRBC組的設(shè)定同WT小鼠；SRBC+iNO組動物在SRBC復(fù)蘇之前10分鐘吸入80ppmNO并持續(xù)2小時(shí)。每組10只動物用作生存率觀察，其余動物在復(fù)蘇后2小時(shí)處死，取血樣和器官留作后續(xù)分析。
　　【

19、結(jié)果】HFD小鼠血壓的基礎(chǔ)值顯著高于WT小鼠（P<0.001）。復(fù)蘇后各組之間MAP沒有明顯差異。通過Kaplan-Meier生存曲線比較，F(xiàn)RBC或SRBC復(fù)蘇對WT小鼠短期生存率（12小時(shí)）和長期生存率（7天）均沒有顯著差異（P=NS）。與WT小鼠相比，SRBC復(fù)蘇的HFD小鼠長期生存率顯著降低（0％比40％，P<0.05）。HFD小鼠中，SRBC復(fù)蘇小鼠的短期生存率和長期生存率與FRBC組相比顯著降低。吸入80ppmNO明顯增加S