家兔RERG、TGFBR1基因多態(tài)性與生長性狀關(guān)聯(lián)性分析及TGFBR1對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長的影響.pdf

1、Ras超家族是一類重要的功能蛋白，它們介導(dǎo)生長因子、細(xì)胞因子和多種細(xì)胞外信號的信息通路，對細(xì)胞生長、分化、存活、增殖等多種功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。Ras家族成員RERG(Ras-related，estrogen-regulated，growth-inhibitory)是GTP/GDP的分子開關(guān)和生長抑制活性基因;轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowth factor-β)是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的超家族，TGF-βⅠ型受體

2、(transforming gowth faetor preeeptorl TGFβR1/TGFBR1)通過TGF-β/Smad信號通路在細(xì)胞生長中起負(fù)調(diào)控作用。本實驗選取RERG和TGFBR1基因為生長候選基因，以伊拉兔、新西蘭兔、艾哥肉兔和天府黑兔共計978個樣本為試驗材料，采用直接測序法尋找兩個基因編碼區(qū)的SNPs位點。通過HRM技術(shù)對兩個基因候選SNPs位點進行基因分型，分析候選SNPs位點與家兔生長的相關(guān)性。隨后，選取剛出生的

3、新西蘭兔仔兔為實驗材料，使用酶消化法結(jié)合percoll非連續(xù)密度梯度離心法，分離、純化家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skeletal muscle satellite cells，SCs)，采用siRNA介導(dǎo)的TGFBR1基因沉默表達，研究其對家兔SCs增殖的影響。主要結(jié)果如下:
　　1.在RERG基因外顯子5上檢測到3個同義突變位點，分別是c.255 T＞A，c.264 G＞A，c.330 G＞A，三個SNPs位點完全連鎖。選取c.330

4、 G＞A位點采用HRM技術(shù)對423只家兔（天府黑兔183只，新西蘭兔120只，艾哥肉兔65只，伊拉兔55只）進行基因型分型，并進行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果表明:RERG基因AA基因型84日齡體重和42-84日齡日增重顯著高于AG基因型;新西蘭兔AA基因型個體84日齡體重顯著高于GG基因型個體;伊拉兔AA基因型個體42-84日齡平均日增重顯著高于GG基因型。
　　2.在TGFBR1基因外顯子8上檢測到一個SNP位點，c.1264 C＞A，氨

5、基酸密碼子由CGG突變?yōu)锳GG，屬于同義突變，只檢測到CC、CA兩種基因型。采用HRM技術(shù)對555只家兔（天府黑兔206只，新西蘭兔188只，艾哥肉兔161只）對c.1264位點進行基因分型，并進行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果表明:艾哥肉兔AA基因型個體56日齡體重顯著高于AC基因型個體;天府黑兔和新西蘭兔AA基因型個體70日齡體重顯著高于AC基因型個體;三個品種家兔AA基因型個體84日齡和42-84日齡平均日增重都顯著高于AC基因型。
　　

6、3.選取剛出生的新西蘭白兔后腿肌組織分離、純化得到的SCs，通過形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化檢測Desmin標(biāo)志蛋白，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中Desmin呈陽性表達。表明本試驗所分離、純化得到的細(xì)胞為家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，且純度滿足后續(xù)試驗要求。
　　4.針對TGFBR1基因，設(shè)計三對特異的siRNA序列轉(zhuǎn)染SCs，通過q-PCR檢測TGFBR1基因mRNA的相對表達量，篩選最佳siRNA是si-TGFBR1-01，最佳轉(zhuǎn)染濃度50nmol/L si-T

7、GFBR1-01，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后對靶基因的mRNA表達水平的抑制效率為87.61％。
　　5.轉(zhuǎn)染si-TGFBR1-01后TGFBR1基因mRNA表達量下調(diào)，同時TGF-β/Smad信號通路下游基因Smad3基因也有一定程度下調(diào)，作為TGFBR1基因的配體基因TGFB1基因mRNA表達量出現(xiàn)上調(diào)，MSTN基因mRNA表達量下調(diào)，表明TGFBR1基因通過TGF-β/Smad信號通路對骨骼肌細(xì)胞增殖相關(guān)基因起負(fù)調(diào)控作用。

8、　　6.對數(shù)期的SCs細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染實驗，檢測在轉(zhuǎn)染50nmol/L si-TGFBR1-0148h后對細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFBR1基因mRNA被抑制表達后，細(xì)胞增殖能力顯著高于對照組(P＜0.05)，說明TGFBR1對骨骼肌細(xì)胞的增殖起負(fù)調(diào)控作用。
　　家兔RERG和TGFBR1基因CDS區(qū)的SNPs與生長速度顯著相關(guān)，RERG和TGFBR1基因可作為影響家兔生長性狀的重要候選基因。通過對TGFBR1基因的抑制表達，證