E64d對(duì)腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性和神經(jīng)功能的影響及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的：研究E64d通過凋亡-自噬途徑對(duì)TBI后神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性及神經(jīng)功能的作用,并對(duì)其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法：采用改良的自由落體損傷裝置建立小鼠定量腦外傷(traumatic braininjury,TBI)模型,實(shí)驗(yàn)組側(cè)腦室注射E64d(cathepsinB和μ-calpain的特異性抑制劑,0.5μg/1μ1)或等體積1％DMSO,并按傷后時(shí)間不同分為傷后1h,6h,12h,24h,和48h組,各組分別于處死前

2、1h用腹腔注射法將碘化丙啶(propidium iodide,PI)注入各組小鼠體內(nèi),采用體視學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)各組損傷及其周邊區(qū)(皮質(zhì)與海馬)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),研究組織蛋白酶對(duì)TBI引起的神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞的影響；用組織缺損體積(lesion volume,LV)評(píng)估TBI后腦組織損害的情況,研究組織蛋白酶對(duì)TBI后腦組織損害的影響；采用行為學(xué)試驗(yàn)(Motor Test和Morris水迷宮試驗(yàn))評(píng)估TBI后各組動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶的情況,研究

3、組織蛋白酶對(duì)TBI后神經(jīng)功能損害的影響。運(yùn)用Western blot法和免疫組織熒光法觀察TBI后各實(shí)驗(yàn)組腦組織中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3,bcl-2,tBid,bax,自噬/溶酶體途徑相關(guān)蛋白cathepsinB,LC3,P62的表達(dá)情況,進(jìn)一步研究溶酶體酶對(duì)凋亡和自噬通路的影響以及兩種通路的相互關(guān)系,期望為E64d對(duì)TBI后神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性及神經(jīng)功能保護(hù)的調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 結(jié)果：PI計(jì)數(shù),形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)

4、和行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,與相對(duì)應(yīng)各時(shí)段DMSO對(duì)照組比較,用E64d阻滯cathepsinB和μ-calpain后,損傷區(qū)PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,缺損體積減小,運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶功能有所改善；凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、tBid、bax)、自噬/溶酶體途徑相關(guān)蛋白(cathepsinB、P62)的表達(dá)量降低,且以24h~48h最為顯著(P＜0.05)；抗凋亡蛋白bcl-2和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)。
　　

5、結(jié)論：1.TBI可以造成神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞,TBI后24h～48h質(zhì)膜完整性遭破壞的細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰,表現(xiàn)為PI陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多；E64d可以減輕TBI造成的神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性破壞程度；2.E64d可以減小TBI后腦組織的缺損體積；3.TBI可引起運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶功能損害,E64d可以明顯改善TBI后運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶功能；4.自噬/溶酶體途徑、凋亡途徑均參與腦外傷的病理過程；5.E64d抑制cathepsinB和μ-calpain后凋亡和