對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)三種主要結(jié)構(gòu)蛋白相互作用位點(diǎn)及病毒衣殼性質(zhì)的研究.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是一種桿狀型雙鏈DNA(～300kb)病毒。該病毒具有雙層囊膜，且不能形成包涵體，隸屬于線形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒屬(Whispovirus)。WSSV具有廣泛的宿主范圍，具有傳染力強(qiáng)，致死率高的特點(diǎn)，難以防治。這不僅嚴(yán)重危害對(duì)蝦養(yǎng)殖，同時(shí)也會(huì)對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境構(gòu)成巨大的威脅。本文主要圍繞病毒結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用的位點(diǎn)進(jìn)行深入的研究，此外，還對(duì)

2、病毒衣殼的構(gòu)成形式、理化耐受性質(zhì)進(jìn)行了研究。研究工作的內(nèi)容主要包括了以下兩個(gè)方面:
　　 (1)WSSV病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP24(wsv002)、VP26(wsv311)和VP28(wsv421)是構(gòu)成囊膜和莢膜的重要組成部分，三者之間均存在著相互作用。為了進(jìn)一步了解和掌握囊膜以及莢膜蛋白具體的作用位點(diǎn)和結(jié)合形式，首先利用PCR和基因重組技術(shù)，在載體pET-28a-V5和pET-His上構(gòu)建了3種蛋白的系列缺失突變表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)

3、共轉(zhuǎn)化的技術(shù)，共同表達(dá)分別帶有V5標(biāo)簽和His標(biāo)簽的多肽，利用Co-IP等蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，鑒定了VP28/VP24及VP24/VP26之間相互作用的具體結(jié)合區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP24上存在3個(gè)與VP28相互作用的位點(diǎn)，分別為:N端46/61aa、C端148/172aa、C端189/208aa; VP28上存在1個(gè)與VP24作用位點(diǎn)為N端31/65aa;此外VP24上存在3個(gè)與VP26相互作用位點(diǎn)，分別為N端26/46aa、C端148/

4、172aa、C端189/208aa; VP26上存在一個(gè)與VP24作用位點(diǎn)為C端171/204aa。
　　 (2)雖然構(gòu)成WSSV病毒核衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白已報(bào)道，但是對(duì)于核衣殼或衣殼的一些理化性質(zhì)至今并不清楚。為了進(jìn)一步研究了解核衣殼性質(zhì)以及裝配組裝機(jī)制，并基于之前本實(shí)驗(yàn)室的研究成果，本論文利用去除DNA以后的衣殼代替核衣殼進(jìn)行研究，以排除DNA對(duì)核衣殼性質(zhì)和構(gòu)成所產(chǎn)生的影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同條件（溫度、pH、尿素、SDS、尿素或SDS

5、混合β巰基乙醇）處理衣殼，利用SDS-PAGE以及透射電子顯微鏡(TEM)分析處理后的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)衣殼在37℃、45℃時(shí)形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，隨著溫度逐漸到達(dá)60℃、80℃、100℃時(shí)具體結(jié)構(gòu)也逐漸消失并聚合在一起，但整體框架尚存;衣殼的形態(tài)結(jié)構(gòu)在pH9.0、pH9.5、pH10.0時(shí)保持正常，當(dāng)?shù)竭_(dá)pH10.5時(shí)結(jié)構(gòu)發(fā)生松散并解聚，當(dāng)?shù)竭_(dá)pH11.0時(shí)衣殼發(fā)生降解并已無(wú)具體形態(tài)結(jié)構(gòu);在低濃度尿素情況下，衣殼最快在2M尿素處理24h后產(chǎn)生形態(tài)

6、結(jié)構(gòu)上的變化，鎂離子存在的情況下，衣殼的形態(tài)可以保持到2.5M尿素處理12h以后才發(fā)生變化;衣殼形態(tài)最低在1mM SDS就能發(fā)生變化和解聚。通過(guò)5％β巰基乙醇混合2mM SDS處理衣殼，衣殼的結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化，但無(wú)法使衣殼粒完全解聚。為進(jìn)一步分析，通過(guò)1.6M高鹽混合2M尿素的條件并以不同條件（pH10、超聲、反復(fù)凍融）處理衣殼，嘗試獲取衣殼粒。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)解聚的后衣殼粒以不均一的形式結(jié)合。
　　 總而言之，本文對(duì)于WSSV病毒