16775.灰葡萄孢霉(botrytiscinerea)bc31倍半萜環(huán)化酶基因及氮調(diào)節(jié)因子area基因與aba合成關(guān)系研究

1、ByDengHongyuanADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofScienceChengduInstituteofBiology，theChineseAcademyofSciencesNov，2012●‘一q誓S—k一灰葡萄孢霉(Botwt

2、iscinerea)BC31倍半萜環(huán)化酶基因及氮調(diào)節(jié)因子AREA基因與ABA合成關(guān)系研究且都表現(xiàn)出一定的由弱到強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)模式，與ABA合成在時(shí)間上有協(xié)同性。故所選擇的5個(gè)環(huán)化酶基因均作為下一步敲除對(duì)象。第二章：CaCl2PEG介導(dǎo)的BcinereaBC31原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。CaCl2PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化是Bcinerea最常用的遺傳轉(zhuǎn)化體系，原生質(zhì)體的制備和再生是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。按文獻(xiàn)報(bào)道的方法操作無(wú)法滿足轉(zhuǎn)化所需的原生質(zhì)體

3、數(shù)量和再生率的要求，故主要針對(duì)原生質(zhì)體的制備和再生進(jìn)行了一系列條件研究和優(yōu)化。首先改進(jìn)了菌絲體培養(yǎng)方式，由文獻(xiàn)報(bào)道的液體培養(yǎng)改進(jìn)為以覆蓋玻璃紙的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)果證明簡(jiǎn)便易行，原生質(zhì)體得率和再生率得到顯著提高。進(jìn)一步對(duì)菌絲體菌齡、去壁酶酶解時(shí)間和溫度、再生培養(yǎng)基滲透壓穩(wěn)定劑種類和濃度、再生培養(yǎng)基pH等進(jìn)行了研究，獲得較優(yōu)的制備條件為：以覆蓋玻璃紙的PDA培養(yǎng)，菌齡72h，酶量05％(w／v)，酶解溫度26℃一28℃，80rpm振蕩酶解

4、10h15h；再生培養(yǎng)基條件為：05M蔗糖5mMHEPESImM磷酸氫二銨12％Agar，pH50。該條件下原生質(zhì)體平均得率約為262106／100mg菌體，平均再生率達(dá)到20％左右，原生質(zhì)體得率和再生率較改進(jìn)前有大幅提高，且均已滿足遺傳轉(zhuǎn)化的要求。繼而，測(cè)試了擬用于后繼轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的pBARKSl載體對(duì)所制備的原生質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其空載體轉(zhuǎn)化率平均為3個(gè)／ggDNA，與國(guó)際同行報(bào)道的轉(zhuǎn)化率接近。至此，建立起了適用于本實(shí)驗(yàn)室ABA產(chǎn)

5、生菌株BcinereaBC31的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為本論文的后繼工作以及本實(shí)驗(yàn)室的后繼基因功能研究打下基礎(chǔ)，也可供其它實(shí)驗(yàn)室借鑒和參考。第三章：BcinereaBC一31倍半萜環(huán)化酶基因及Area基因敲除研究。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室ABA產(chǎn)生菌BcinereaBC31的5個(gè)倍半萜環(huán)化酶基因和一個(gè)氮調(diào)節(jié)蛋白基因Area進(jìn)行了基因敲除研究，每個(gè)基因均獲得來(lái)自不同批次的兩個(gè)以上的敲除突變體，共獲得陽(yáng)性敲除突變體17株。采用HPLC檢測(cè)突變株ABA產(chǎn)量，其中C